PDを標的とした二重特異性抗体の開発

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18011 (2022) この記事を引用

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プログラムデスリガンド 1 (PD-L1) と Ig および ITIM ドメインを持つ T 細胞免疫受容体 (TIGIT) はがん免疫療法の 2 つの潜在的な標的であり、初期の臨床研究では抗 PD-L1 と抗 TIGIT の併用療法が相乗効果があることが示されました全奏効率（ORR）と全生存期間（OS）の両方の観点からです。 PD-L1 と TIGIT を標的とする二重特異性抗体を構築することは合理的であり、併用療法の有効性を維持することに加えて、二重特異性抗体 (BsAb) は腫瘍細胞と T/NK 細胞間の架橋などの新しい作用機序を提供できます。今回、最適な細胞毒性を備えた IgG1 型二重特異性抗体を開発しました。この研究では、さまざまな方向とリンカー長を持つ 16 種類の IgG-VHH フォーマットを徹底的に調査しました。その結果、(G4S)2 リンカーが 2 つの結合ドメインを適切に分離するだけでなく、タンパク質収量が最も高いことが実証されました。さらに、ＶＨＨ−ＨＣ配向は、重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の重鎖の可変ドメインの結合および細胞傷害活性を完全に維持した。 BiPT-23 による治療後、細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) およびナチュラルキラー (NK) 細胞の浸潤が増加し、制御性 T 細胞 (Treg) が選択的に除去され、in vivo での腫瘍増殖が大幅に抑制されました。 BiPT-23 は、PD-1 阻害によりがんの過剰進行を防ぐように設計された新しい免疫療法であり、PD-L1+ 腫瘍細胞および TIGIT+ Treg を優先的に死滅させますが、腫瘍微小環境 (TME) 内で CD11b+F4/80+ 免疫細胞を維持します。

過去 20 年間、二重特異性抗体は凝固欠損症 1 やがん 2、3、4 の治療に大きな機会を提供してきました。 1997 年から 2020 年にかけて二重特異性抗体の 272 件の臨床試験が行われ、BsAbs には数百のフォーマット 5 と約 6 つの作用機序 6 があり、作用機序 (MOA) に従って、異なるフォーマットを採用する必要があります。ただし、すべてのフォーマットが工業的製造に適しているわけではなく、IgG 様および BiTE は良好な開発性を備えていることが証明されており、特許で保護されています 7。 19938 年に VHH が発見されて以来、VHH は学術研究機関やバイオテクノロジー企業から大きな注目を集めてきました。 2019年に米国食品医薬品局（FDA）がカプラシズマブを承認したことで、VHH9の普及が加速した。サイズが小さい (15 kDa) ため、VHH を使用して二重特異性抗体を構築するのが便利です。

すべての臨床試験のうち、17.28% が二重チェックポイント阻害でした10。免疫チェックポイント阻害剤には、がん免疫療法を再定義する可能性がありました。最近、T 細胞免疫グロブリンおよび ITIM ドメイン (TIGIT) が腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) 上で PD-1 と共発現していることが判明し 11、PD-L1/PD-1 遮断と抗 TIGIT の組み合わせは優れた効果を示しました。 PD-L1 陽性（腫瘍割合スコア [TPS] ≥ 1%）がん患者における PD-L1/PD-1 単剤と比較した ORR および OS12。中国では、PD-L1 および TIGIT を標的とするいくつかの二重特異性抗体が臨床開発中です 13,14 が、いずれも抗体依存性細胞傷害 (ADCC) および抗体依存性細胞食作用 (ADCP) を誘導するように最適化されていませんでした。

腫瘍では、PD-L1 は腫瘍細胞 15 と免疫細胞 16 の両方で発現しており、前臨床データにより、機能性 Fc が ADCC を介して PD-L1 陽性免疫抑制骨髄細胞に対する PD-L1 抗体の抗腫瘍活性を増強できることが明らかになりました 17。腫瘍細胞18．承認済みまたは臨床試験中のいくつかの PD-L1 抗体は、エフェクター機能を備えた IgG1 モノクローナル抗体です 19。最近、研究者らは抗 TIGIT モノクローナル抗体 (mAb) T4 を開発しました。これは腫瘍内制御性 T 細胞の頻度を大幅に減少させ、さらなる抗腫瘍 CD8+ T 細胞応答を活性化しました 20。 FcγR結合能力を強化するためのその後のFcエンジニアリングにより、抗腫瘍効果がさらに向上しました20。さらに、APC 上の FcγR との相互作用により、抗 TIGIT21 に対する抗原特異的 T 細胞応答が改善される可能性があります。要約すると、PD-L1およびTIGIT遮断のためのFc-FcγR相互作用は、NKによる腫瘍細胞およびTregの枯渇を助けるだけでなく、T細胞と抗原提示細胞（APC）間のクロストークも強化する。

この研究では、BsAb の細胞毒性と IgG-VHH 形式の関係を系統的に調査しました。まず、IgG と VHH に基づいて 16 個の BsAbs を構築し、VHH と IgG の軽鎖の結合により HC と LC の間のペアが弱くなることを実証しました。次に、重鎖の N 末端に VHH を配置すると、親 VHH の細胞毒性が維持されるが、C 末端では維持されないことを確認しました。最後に、in vivo 抗腫瘍活性により、最上位候補が MC38 結腸癌の増殖を抑制し、腫瘍内 Treg 細胞の頻度を低下させ、NK 細胞および T 細胞を増加させ、腫瘍内の DC およびマクロファージを含む CD11b+F4/80+ 免疫細胞を維持できることが示されました。 TME。

YN035 (IgG、抗 PD-L1) および hTIGI7.6、hTIGI7.11E (VHH、抗 TIGIT) は、以前に Oricell Therapeutics によって開発されました。 hTIGI7 の同じ前駆体配列に由来する hTIGI7.6 および hTIGI7.11E は、CDR3 にわずかなアミノ酸の違いしかありませんでした。 YN035 および hTIGI7.6 に基づいて、異なる形式とリンカー長を持つ 16 個の二重特異性抗体 (付加 IgG) を設計しました (図 1)。二価性は結合体形成を改善し、TIGIT 発現 T/NK 細胞が PD-L1 腫瘍細胞に近づくのに役立つ可能性がある 22 だけでなく、親抗体の遮断活性も維持する可能性があります。柔軟で可溶性のリンカーの最良の選択肢は (G4S)n で、これはある程度の移動を必要とするドメインの接続に適用されました 23。最も長いリンカーは (G4S)3 で、約 5.7 nm 23 と計算され、免疫シナプスの距離 (13 nm) 24 よりも短かった。 n の数を簡単に調整することで、リンカーにより BsAbs が適切にフォールディングされ、最高の収率と最適な生物学的活性が達成されました。私たちの設計では、n ≥ 4 は避けられましたが、一方で (G4S)3 は 2 つの結合ドメインを分離するのに十分な長さでした 25。一方、GSG は O-キシロシル化のモチーフであり、リンカー内の GSG モチーフの数が増加するにつれて、キシロシル化の総量も増加します 26。

二重特異性抗体の設計。緑色は TIGIT に対する VHH、濃い青色は抗 PD-L1 の重鎖、茶色は軽鎖、黒色はリンカーです: (GGGGS)n、n = 0–3。

すべての BsAb は EXPI293 細胞 (Thermo Fisher Scientific、A14527CN) で発現されており、プロテイン A で精製した後、分析用サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) を使用して BsAb の凝集と解離を評価しました (図 2)。このアッセイでは、BsAb は理論的に 180 kDa (1 つの 150 kDa IgG と 2 つの 15 kDa VHH を含む) と計算され、BsAbs のモノマー溶出時間は約 7.1 ～ 7.4 分でした。すべての BsAb について有意な凝集は観察されませんでした。ただし、8.1 ～ 8.4 分の溶出時間で、IgG-[L]-VHH 形式 (図 2I ～ P) には、BsAbs の重鎖である可能性のある小さなピーク (7 ～ 17%) があり、軽鎖はありませんでした。これは、解離が保存時ではなく、発現または精製ステップで発生したためです。データの結果は、IgG-[H]-VHH 二重特異性抗体が IgG-[L]-VHH よりも安定であることを実証したため、さらなる分析のために AH フォーマット (図 2) を選択し、二重特異性抗体 BiPT-18 から BiPT-18 を構築しました。 25はYN035およびhTIGI7.11Eに基づいています。

1 mg/ml 濃度での 16 個の二重特異性抗体の SEC。 (A ～ H) IgG-[H]-VHH フォーマットでは凝集は示されず、重鎖のみのピークも示されませんでした。 (I – P) IgG-[L]-VHH フォーマットには凝集ピークはありませんでしたが、VHH の軽鎖への結合により HC と LC の結合が弱まり、8.1 ～ 8.4 分の溶出時間に小さなピークがありました。

IgG に対する VHH の影響を調べるために、PD-L1 を過剰発現する 293 T 細胞株を用いたフローサイトメトリーによって BiPT-18-25 の結合能力を分析しました。ここで、すべての IgG-[H]-VHH は、最大有効濃度と最大半値有効濃度 (EC50) の両方の点で同じレベルで PD-L1+ 293 T 細胞に結合しました (図 3A、表 1)。親抗体 YN035 と比較して、BiPT-18-25 は EC50 で 1.5 ～ 2.0 倍の損失を示しましたが、ForteBio アッセイでは親和性の低下は見られませんでした (データは示さず)。さらに、BsAbs 上の CD16a 結合領域に対する VHH の潜在的な影響を評価するために、in vitro 細胞傷害性アッセイを実施し、すべての二重特異性抗体、YN035、hTIGI7.11E、および親抗体の組み合わせを PD-L1+ 293 T で測定しました。およびヒト末梢血単核球 (PBMC) (図 3B)。 hTIGI7.11E を除くすべてのグループは、最大溶解および EC50 に関して同じレベルの細胞毒性を示しました。これらの結果は、重鎖へのVHH融合がFcのCD16aへの結合を妨げないことを示した。次に、BsAb の VHH アームの結合能力と細胞毒性を評価しました。まず、TIGIT を過剰発現する 293 T 細胞株を用いたフローサイトメトリーを行った結果、BiPT-22-25 (VHH-HC 配向) は hTIGI7.11E、BiPT-18-21 (HC-VHH 配向) の結合活性を維持していることがわかりました。は結合の有意な減少を示し、リンカーの長さが短くなるにつれて結合損失が増大した（図３Ｃ、表１）。 VHH が重鎖の C 末端に融合すると、抗原認識に立体障害が生じます。同じ結果が細胞毒性アッセイでも観察され、BiPT-18-21 は BiPT-22-25 と比較して細胞溶解において劣っていました (図 3D、表 1)。要約すると、リンカーの長さは、HC-VHH 配向では VHH の結合と細胞毒性にとって重要ですが、VHH-HC 配向では重要ではありません。 TIGIT 抗体の細胞毒性の重要性を考慮すると、BiPT-22、23、24、および 25 がさらなる開発のより良い候補でした。

BiPT の結合および ADCC 活性。 (A) ヒトPD-L1に対する結合能を示す。 (B) PD-L1 過剰発現 293 T 細胞株に対する ADCC 活性を示します。 (C) ヒトTIGITに対する結合能を示す。 (D) TIGIT を過剰発現する 293 T 細胞株に対する ADCC 活性を示します。

BsAb の生物学的活性に加えて、発現収率と安定性も分析し、BiPT-18-25 をそれぞれ 100 ml と 300 ml の EXPI293 で発現させ、材料と方法と同じ条件下で精製しました。結果は、(G4S)2 リンカーが HC-VHH および VHH-HC 配向の両方で最も高い収率を示すことを示しました (表 1)。安定性アッセイでは、BiPT-22〜25間で差異は示されませんでしたが（図4A、B）、hTIGI7.11Eは60℃でTIGITへの半結合能力を失い、BiPTは損なわれませんでした。予想外の結果により、IgG が BsAbs の VHH の安定化に役立っていることが明らかになりました。逆に、70 °C での VHH の変性により、BiPT-22-25 の PD-L1 への結合能力が妨げられました。すべての結果を考慮すると、BiPT-23 は PD-L1 と TIGIT を同時に結合できる最良の BsAb でした (図 4C)。 BiPT-23 は、ヒト TIGIT-KI C57BL/6 マウスモデルにおける抗腫瘍活性を評価するために選択されました。

BiPT-22-25 の安定性アッセイ。 (A) さまざまな温度で加熱チャレンジした後、25 nM 抗体を PD-L1 過剰発現 293 T 細胞株とインキュベートして、その結合能力を測定しました。 (B) さまざまな温度で加熱チャレンジした後、25 nM 抗体を TIGIT 過剰発現 293 T 細胞株とインキュベートして、その結合能力を測定しました。 (C) BiPT-23 は、ForteBio Octet アッセイにおいて PD-L1 と TIGIT に同時に結合できました。

YN035 はヒトとマウスの PD-L1 間で交差再活性化するため、hTIGI7.11E はヒト TIGIT のみを認識し、ヒト TIGIT はマウスポリオウイルス受容体 (PVR) を交差認識できました 27。我々は、TIGIT ヒト化 C57BL/6 マウスと MC38 結腸癌を使用して in vivo 有効性を評価し、用量依存的な腫瘍退縮を観察しました。 36 mg/kg BiPT-23 は、IgG1-Fc グループと比較して、53.7% の腫瘍増殖阻害 (TGItv) を示しました (図 5A)。 TME内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析により、T細胞が3つのBiPT-23グループで有意に増加したことが示されました(図5E)。増加したT細胞はほとんどがCD8陽性CTLであったが(図5F)、CD4陽性Th細胞はわずかな減少を示した(図5G)。以前の報告のように、TIGITを過剰発現するTreg細胞は、BiPT-23のADCC活性に対するデュオを有意に減少させた（図5H）。さらに、他の PD-L1 陽性免疫細胞の頻度も検出しましたが、BiPT-23 は骨髄サブセットの組成を変化させませんでした (図 5C)。これは、BiPT-23 が PD-L1+ 以外の PD-L1+ 腫瘍細胞を選択的に枯渇させたことを意味します。免疫細胞、別の報告と一致しています28。 NK細胞もチラゴルマブ群とBiPT-23群で増加しましたが、統計的な差はありませんでした（図5D）。 2018年、Zhigang Tian研究室は、TIGITの遮断により腫瘍浸潤NK細胞の消耗が逆転し、CD107a、腫瘍壊死因子、インターフェロン-γ、CD226を発現する腫瘍浸潤NK細胞の頻度が増加することを発見した。

BiPT-23 は in vivo で腫瘍の増殖を阻害し、TME 内の NK および CTL 細胞を優先的に増加させ、Treg 細胞を減少させ、CD11b+F4/80+ 免疫細胞を維持しました。 (A) 3 回投与した BiPT-23 の抗腫瘍活性。 (B) TME 内の生細胞の一部としての mCD45+ 細胞の分析が示されています。 (C) TME 内の mCD45+ 細胞の画分としての mCD11b+ F4/80+ 細胞の分析が示されています。 (D) TME 内の mCD45+ 細胞の一部としての NK 細胞 (CD3-NK1.1+) の分析が示されています。 (E) TME 内の mCD45+ 細胞の一部としての T 細胞 (CD3+) の分析が示されています。 (F) TME 内の mCD45+ 細胞の画分としての CTL 細胞 (CD4-CD8+) の分析が示されています。 (G) TME 内の mCD45+ 細胞の画分としての T ヘルパー (Th) 細胞 (CD4+CD8-) の分析が示されています。 (H) TME 内の mCD4+ 細胞の一部としての Treg 細胞 (CD4+ FoxP3+) の分析を示します。データは平均±SEMとして示され、各グループと比較したTukey検定に続く一元配置分散分析を使用して分析されました。 (*p < 0.05、***p < 0.001)。

PD-L1 はマクロファージを除いてほとんどの正常組織では発現されませんが、その発現は多くのサイトカイン、特にインターフェロン-γ30 によって誘導および維持されます。多くのヒト腫瘍で PD-L1 の高レベルの発現が報告されており 30、活発な抗腫瘍免疫応答中に PD-L1 は腫瘍回避のメカニズムを提供する可能性があります 31。 PD-L1 発現は患者の生存予後不良の指標であり 32、さらに、抗 PD-L1 mAb の応答は、腫瘍以外のマクロファージ、樹状細胞、T 細胞などの免疫細胞上の PD-L1 発現とより相関していました。細胞33．

ヒト IgG1 抗 PD-L1 mAb であるアベルマブは、メルケル細胞癌の治療のために開発され、2017 年に FDA によって承認されました。臨床分析の結果、アベルマブは H460 や H441 などのヒト肺腫瘍細胞株を溶解できましたが、PD-L1 の発現レベルが H46028 と同等であったとしても、がん患者の自己 PD-L1 陽性 PBMC は溶解できなかったことが明らかになりました。コンピテント Fc を含む抗 PD-L1 mAb は、チェックポイント遮断と腫瘍細胞特異的キラーの両方として機能できるようです。さらに、CStone Pharmaceuticalsの公式ウェブサイトによると、同社は、マクロファージによる直接的な腫瘍死滅を誘導し、長期の抗腫瘍免疫のために腫瘍抗原提示を強化するために、承認された抗PD-L1抗体（スゲマリマブ）のADCPを保持していると説明した。

臨床試験では、Tiragolumab (Roche)、Vibostolimab (Merck)、および Ociperlimab (BeiGene) などのほとんどの抗 TIGIT mAb は IgG1-Fc を使用しました 34。共通のメカニズムは、腫瘍微小環境内の TIGIT 過剰発現 Treg の選択的枯渇でした 20。研究者らは、IgG1-Fc の ADCC/ADCP を超えて、細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質 4 (CTLA-4) および TIGIT mAb が最適な T 細胞活性のために APC 上のヒト CD16a の関与を必要とすることを発見しました。 in vitro ヒト PBMC 刺激により、IL-2 分泌が CD16a-hIgG1 相互作用に依存しており、DLE 変異体 Fc が IL-2 産生をさらに増加させることが明らかになりました。機能的 Fc を含む抗 TIGIT mAb は、T 細胞と APC の免疫シナプスの形成に役立つ可能性があります 21。

免疫チェックポイント阻害剤の開発における懸念の 1 つは、PD-L1+ および TIGIT+ 免疫細胞の溶解を理由として、Fc によって媒介される細胞毒性です。しかしながら、機能的Fcはまた、抗腫瘍活性のさらなるMOAを提供する可能性がある。

ここで我々は、完全に機能する Fc を備えた、PD-L1 と TIGIT を標的とする 4 価の二重特異性抗体を開発しました。私たちは VHH を利用して、最適な開発可能性と細胞毒性を備えた最適な二重特異性抗体フォーマットとリンカーを選択しました。私たちは、重鎖 (HC) と軽鎖 (LC) の結合は、融合部位が軽鎖上にある場合、リンカーの長さに関係なく、VHH の位置によって顕著な影響を受けることを発見しました。精製された BsAb に混合された鎖のみの生成物 (図 2I-Q)。 VHH 結合能力もフローサイトメトリーアッセイで損失を受けました (データは示されていません)。 LC の定常領域は、軽鎖の可変領域 (VL) と最長リンカー (GGGGS)3 である VHH を分離しており、その長さは約 5.7 nm23 であるため、VHH がシスで VL と対になる理由はありません。

BsAb 形式と ADCC35 の関係を調査した報告がいくつかあります。かつて研究者らは、IgG および一本鎖可変フラグメント (scFv) に基づく四価 IgG1 デュアルターゲティング IGF-1R-EGFR 抗体を開発しましたが、HC または LC の N 末端への scFv 融合により BsAbs の収量が低下することがわかりました。 BiPT-22–25 で観察されました (表 1)。さらに、HC の C 末端に scFv を結合すると、二重特異性抗体の細胞毒性が完全に消失しましたが、scFv の親和性は 2 倍低下しただけでした。我々のHC-VHH配向形式では、VHHのHCへの融合はFc-FcγR相互作用に差異を生じず(図3)、ADCC活性はVHHの結合能力と正の相関があった(図4)。私たちの研究では、scFv の最適な融合部位は LC の C 末端であったようですが、VHH の場合は HC の N 末端が最良の選択でした。

VHH を安定化するには、相補性決定領域を安定なフレームワークに移植すること、非標準的ジスルフィド結合の導入、厳密な選択に続くランダム突然変異誘発、負または正の電荷の点突然変異、および遺伝子融合など、いくつかの解決策があります 36,37。研究者らはかつて、α-シヌクレイン（ATS）の酸テールを、ジスルフィド結合を欠く単一ドメイン抗体（sdAb）との融合体として使用し、これがsdAb38の安定化に役立っており、sdAbの等電点（pI）を下げると等電点が上昇する可能性があると考えられていました。その安定性39。しかし、私たちの研究では、YN035のHCへのVHHの融合により、加熱チャレンジ後のVHHの結合性能が向上することがわかりました（図4）。同じ結果が40℃の長期安定性でも観察できます。アッセイ（データは示されていない）。 YN035 の pI は 8.54、VHH は 8.34、BiPTs は約 8.50、YN035 の VH は 9.20、YN035 の HC は 8.77、重鎖の可変領域 (VH) と VL の合計は 8.61 と計算されました。理由はありませんでした。 IgGによってVHHのpIを下げるため。逆に、他の報告では、正に帯電した VHH は凝集耐性が高い可能性があることが明らかにされており 37,40 、これは我々の結果と一致しました。

In vivo では、BiPT-23 は、CD8+ T 細胞、NK 細胞の浸潤を促進し、TIGIT+ Treg 細胞を枯渇させることにより、腫瘍の増殖を有意に抑制しました。興味深いことに、BiPT-23 は樹状細胞 (DC) やマクロファージを含む CD11b+F4/80+ 細胞の減少を示さなかった。 DC による PD-L1 発現はがんにおける T 細胞免疫の重要な調節因子であり、PD-1 シグナル伝達は DC による腫瘍抗原の交差提示中の T 細胞応答を制限する可能性があります 41。 BiPT-23 は、PD-L1 および TIGIT の遮断として機能するだけでなく、TIGIT 発現 T 細胞と PD-L1+FcRs+ DC 間のクロストークも強化する可能性があります。私たちの知る限り、BiPT-23 は ADCC 活性に最適化された最初の二重特異性抗体であり、臨床開発の可能性がありました。

将来的には、当社の二重特異性抗体は、インターロイキン 2 やインターロイキン 15 などの NK の増殖と機能を強化するサイトカインと結合して、抗体でコーティングされた腫瘍細胞や通常の T 細胞に対する NK 媒介 ADCC を増強する可能性があります。

293 T 細胞株は American Type Culture Collection (ATCC) から購入しました。

PBMC は健康なドナーから抽出され、インフォームドコンセントが得られました。

マウスを用いたこの研究は、AAALAC ガイドラインに従って Biocytogen によって実施されました。この研究は、バイオサイトジェンの施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するガイドに準拠しています。実験の最後に、動物は過剰な CO2 で安楽死させられました。

この論文のすべての研究は、ARRIVE ガイドラインに従って実施されました。

OPM-293 CD05 培地 (OPM、12112701)、SMM293-TII (SB、RZ14JL0801)、および 8 mM Gluta MAX-1 (100x) (gibco、2085465) を使用して、1.6 × 106 細胞/ml の密度までの EXPI293 の増殖をサポートしました。、37 °C、相対湿度 80% 以上、CO2 8%、120 rpm オービタルシェーカー内でインキュベートします。翌日、EXPI293 細胞は 3 × 106 生細胞/ml の密度に達しました。 OPTI-MEM (gibco 2120548) を使用してプラスミド DNA と 1 mg/ml PEI (プラスミド DNA:PEI = 1:2) を希釈し、複合体を 2 ～ 3 回穏やかに反転し、室温で 5 分間インキュベートしました。希釈したPEIを希釈したプラスミドDNAに添加し、混合物を室温で20分間置き、その後、溶液を細胞培養に移した。 5日間のインキュベーション後、培養物を8000gで10分間遠心分離し、上清を0.5μmフィルター(cobetter、OES0423)で濾過した。

AKTA avant 25(GE) の電源を入れ、10 ml Mab SelctSure (GE) カラムをシステムに接続し、流速を 3 ml/min に設定し、ベースラインが得られるまでカラムを 0.5 M NaOH および 1×PBS で順次洗浄しました。平らにしてからサンプルをカラムに流しました。サンプル上清がカラムシステムを通過したら、ベースラインが平らになるまでカラムを 1×PBS で洗浄し、0.1 M Gly-HCl、pH3.0 を使用してタンパク質を溶出し、1 M Tris-HCl で中和しました。 50 ml G-25 脱塩カラムをシステムに接続し、流速を 8 ml/min に設定し、ベースラインが平らになるまで 0.2 M NaOH と 1xPBS でカラムを次々に洗浄しました。収集したタンパク質を、０．２２μｍフィルター（Ｐａｌｌ、ＦＧ１３７５）を通してろ過し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＪ２９２５９８）によって濃度を決定した。

高速液体クロマトグラフィー (Agilent Technologies 1200 シリーズ) をオンにし、まず MilliQ 純水を流量 2 ml/min で使用してシステムパイプライン内の空気を除去し、SET-C SEC-300 (セパックス、2F36102) を接続しました。 ) 30 分間洗浄した後、器具に取り付けます。次に、MilliQ 純水で流速 0.5 ml/min で 1 時間カラムを洗浄し、流速 1 ml/min で PBS をさらに 1 時間使用しました。抗体を 1 mg/ml に希釈し、100 μl のマーカーと希釈した抗体をそれぞれサンプルチューブに取ります。マーカーローディングボリュームを6μl、流速1ml/分に設定し、20分間実行した後、抗体ローディングボリュームを10μl、流速1ml/分に設定し、20分間実行しました。

ヒト TIGIT 発現 293 T 細胞およびヒト PD-L1 発現 293 T 細胞の消化および遠心分離後、それらを 0.1% BSA を含む PBS に再懸濁し、4E4 細胞を 96 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 30 μl 加えました。対応する抗体を 200 nM に希釈し、その後 11 の勾配で 3 倍に希釈し、最後の勾配には抗体を添加しませんでした。 30μlの抗体溶液を細胞懸濁液と混合し、4℃で1時間インキュベートしました。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、毎回５００ｇで５分間遠心分離した。抗ヒト IgG Fc-650 二次抗体（abcam、カタログ番号：ab98593）を 0.1% BSA 含有 PBS で 1:200 倍に希釈し、各ウェルに 30 μl 加え、4 °C で 30 分間インキュベートしました。分。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄した。最後に、０．１％ＢＳＡを含む３０μｌのＰＢＳで細胞を再懸濁し、ｉＱｕｅマシンでデータを読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄを使用して４パラメータフィッティング曲線を作成し、ＥＣ５０を計算した。

BiPT-22、BiPT-23、BiPT-24、BiPT-25、YN035、および hTIGI7.11E をそれぞれ PBS で 100 nM に希釈し、20 °C、30 °C、40 °C、50 °C、60 °C でインキュベートしました。 °C、70°C、80°C、90°Cで1時間、25nMの濃度でフローサイトメトリーを実行し、すべての抗体の結合能力を検出しました。

BiPT-23 の二重標的結合は、OCTET RED384 機器 (Sartorius) の BLI を使用して測定されました。 100 nM BiPT-23 を、抗ヒト Fc キャプチャー (AHC) バイオセンサー (Sartorius AG) によって 200 秒間捕捉しました。 PD-L1 と TIGIT の結合濃度は 100 nM、結合相は 400 秒、解離相は 800 秒で、その後グリシン溶液 (pH = 1.5) で 5 秒再生しました。

ヒト TIGIT または PD-L1 とルシフェラーゼの両方を安定して発現する 293 T 細胞株を構築し、標的細胞を計数し、遠心分離し、「DMEM + 10% FBS」培地に標的細胞 1 ウェルあたり 5000 細胞で再懸濁しました。 PBMCをPBSで3回洗浄し、500gで5分間遠心分離、400gで5分間遠心分離、300gで5分間遠心分離、すべての遠心分離は室温で実施した。エフェクター細胞を「DMEM + 10% FBS」培地に再懸濁し、ウェルあたり 1.75E5 細胞とし、有効細胞と標的細胞の比率は 35:1 でした。初期使用濃度までの希釈抗体: 100 nM、8 倍希釈、7濃度勾配、50μl/ウェル。背景が不透明な 96 ウェル細胞培養プレートでターゲット細胞、エフェクター細胞、抗体を混合し、ターゲット細胞の別のウェルを同時にコントロールとして設定しました。 37 °C のインキュベーターで 48 時間インキュベートした後、プレート内のルシフェラーゼの含有量を Tecan リーダーで検出しました。溶解率 (%) = (ターゲット細胞ウェル n - 抗体ウェル m) / ターゲットウェル n × 100。

PBS に再懸濁した 5 × 105 個の MC38 細胞を、雌 TIGIT ヒト化 C57BL/6 マウスの右脇腹に皮下移植しました。平均腫瘍体積が 100 ± 50 mm3 に達したとき、腫瘍体積と体重に基づいてマウスを選択しました。適格なマウスをランダムに 5 つの実験グループに割り当て、各グループに 6 匹のマウスを割り当てました。マウスを、３日ごとに１回、合計６回、示されたタンパク質またはヒトＩｇＧ１－Ｆｃで１０ｍｇ／ｋｇで処置した。ノギスを使用して腫瘍体積を収集し、変形楕円体公式「長さ1/2m n 幅」を使用して体積を計算した。実験後、マウス腫瘍組織を収集して単細胞懸濁液を調製し、LD-eF506 および抗体: 抗 mCD16/32、抗 mCD45-APC/Cy7、抗 mCD3ε-PerCP/Cy5.5 で染色しました。、抗mCD4-PE、抗mCD8a-BV605、抗mNK1.1-BV421、抗m/hCD11b-APC、抗mF4/80-FITC、抗m/rFoxp3-PE/Cy7。 TGITV(%) = [1 − (Ti − T0)/(Vi − V0)] × 100% (Ti: 投与 i 日目の治療群の平均腫瘍体積、T0: 治療の平均腫瘍体積投与０日目の群；Ｖｉ：投与ｉ日目のＩｇＧ１－Ｆｃ対照群の平均腫瘍体積、Ｖ０：投与０日目のＩｇＧ１－Ｆｃ対照群の平均腫瘍体積）。データは平均値±SEMとして示され、各グループと比較したTukey検定に続く一元配置分散分析を使用して分析されました(*p<0.05、***p<0.001)。

すべてのデータは記事内に含まれています。

二重特異性抗体

全体的な応答率

全生存

重鎖のみの抗体の重鎖の可変ドメイン

プログラムされたデスリガンド 1

Ig および ITIM ドメインを持つ T 細胞免疫受容体

モノクローナル抗体

細胞傷害性Tリンパ球

ナチュラルキラー

抗体依存性細胞毒性

抗体依存性細胞食作用

重鎖

軽鎖

抗原提示細胞

樹状細胞

腫瘍微小環境

腫瘍浸潤リンパ球

制御性T細胞

IgG1-Fc の Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu

最大有効濃度の半分

免疫グロブリンG

作用機序

米国食品医薬品局

ヒト末梢血単核球

ポリオウイルス受容体

細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質 4

等電点

重鎖の可変領域

軽鎖の可変領域

単鎖可変フラグメント

樹状細胞

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Zhenwei Zhong、Mengyao Zhang、Yanan Ning、Guanchao Mao の著者も同様に貢献しました。

研究開発部門、Oricell Therapeutics、Origincell Industrial Park、No. 1227 Zhangheng Road、Pudong New District、Shanghai、201203、中国

Zhenwei Zhong、Yanan Ning、Xiaopei Li、Qi Deng、Xiaorui Chen、Dongliang Zuo、Xiangyu Zhao、Ermin Xie、Huajing Wang、Lina Guo & Xiaowen He

上海中医薬大学大学院、上海医科保健大学、上海、201203、中国

張夢耶 & 李伯華

海軍医科大学海軍医学部、化学物質に対する防御医学部門、上海、200433、中国

グアンチャオ・マオ＆カイ・シャオ

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ZZ と XH はこの研究を概念化し、結果を解釈し、原稿を起草しました。 ZZ、MZ、YN、GM、XL、QD、XC、DZ、XZ、EX で実験を行いました。 ZZとHWはフィギュアを用意しました。 XH が研究を監督しました。すべての著者が原稿についてコメントしました。

Zhenwei Zhong または Xiaowen He への対応。

Zhenwei Zhong、Yanan Ning、Qi Deng、Xiaorui Chen、Dongliang Zuo、Ermin Xie、Huajing Wang、Lina Guo、および Xiaowen は、抗体および CAR-T 治療薬を開発および商品化する Oricell Therapeutics の現従業員です。

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転載と許可

Zhong、Z.、Zhang、M.、Ning、Y. 他。最適な細胞毒性を備えた PD-L1 および TIGIT を標的とする二重特異性抗体の開発。 Sci Rep 12、18011 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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受信日: 2022 年 7 月 19 日

受理日: 2022 年 10 月 21 日

公開日: 2022 年 10 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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