hiPSCから選別された細胞

Communications Biology volume 6、記事番号: 483 (2023) この記事を引用

1269 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

最近では、腎近位尿細管のモデル化に多数の微小生理学的システムが使用されています。しかし、近位尿細管上皮層の機能、つまり選択的な濾過と再吸収を改良することに関する研究は不足しています。この報告では、ヒト人工多能性幹細胞由来腎臓オルガノイドから抽出した擬似近位尿細管細胞を、不死化近位尿細管細胞と組み合わせて培養します。共培養された組織は、特定のトランスポーター、細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンとラミニンのレベルが向上し、優れたグルコース輸送とP-糖タンパク質活性を提供する不浸透性上皮であることが示されています。各細胞型から得られたものよりも高い mRNA 発現レベルが検出され、これら 2 つの細胞間の異常な相乗的クロストークが示唆されました。同時に、成熟時にヒト臍帯静脈内皮細胞に曝露された不死化近位尿細管組織層の形態的特徴と性能の改善が徹底的に定量化され、比較されます。グルコースとアルブミンの再吸収、および P 糖タンパク質を介した生体異物の流出速度がすべて改善されました。同時に提示されたデータは、共培養上皮層と非 iPSC ベースの二重層の利点を強調しています。ここで提示される in vitro モデルは、個別化された腎毒性研究に役立ちます。

腎髄質の外側の縞に位置する近位尿細管は、ナトリウム、水、アミノ酸、および他の必須栄養素（グルコースやアルブミンなど）の再吸収の主要な部位であり、そうでなければ糸球体濾液から廃棄される1,2。したがって、臓器は非常に重要であり、さまざまなモデル化の試みが行われてきました3、4、5、6、7。

最近のデータは近位尿細管上皮に対する内皮血管構造の影響を明確に示しています 6 が、以前のモデルでは初代細胞または不死化細胞株が使用されていたため、上皮組織自体の最適化に関する研究はまだ不足しています。 1 つの選択肢は、再現性とはるかに優れた in vivo のような特性を提供する能力を目的として幹細胞を利用することです。それにもかかわらず、ネフロン前駆細胞は出生時にすべて使い果たされてしまうため、成人の臓器でネフロンを産生できる幹細胞の供給源は存在しません8,9,10。一方、胎児の腎臓から腎前駆細胞を取得することは倫理的に不適切に思われるかもしれません。

あるいは、このような前駆細胞はヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) から再作成され、段階的なプロトコルを介してさまざまな種類の腎細胞に直接分化することができます 11、12、13、14。最近、近位尿細管様細胞がオンチップ評価目的で iPSC 株から直接生成されていますが 15、一般に、そのような特殊な製品には生体内に存在する 3D ニッチが欠けています。

この目的を達成するために、我々は、hiPSC 由来の腎臓オルガノイドから細胞を抽出するというアイデアを開始します。 hiPSC 由来の腎臓オルガノイドは、発生後期を再現しており、複雑な 3D 構造を持ち、すべての腎臓系統の細胞を含むため、より in vivo に近い特徴を持つ細胞の供給源として適しています。さらに、それらは、胚性ネフロン前駆細胞を取得して分化するという倫理的課題を抱えていない。

いくつかの研究では、ヒト多能性細胞 (hPSC) を分化させることによって腎臓オルガノイドを生成するというアイデアが提唱されています 13、14、16、17、18。しかし、ヒトの腎臓の発達に関与する 4 つの前駆細胞集団、つまりネフロン、尿管上皮、内皮、および腎間質前駆細胞から、これらのプロトコルのほとんどは最初の 2 つを作成し、ネフロンまたは集合管のみを形成します。高里らによって紹介された hPSC の腎臓オルガノイドへの分化プロセス。ヒトの腎臓器官形成の全過程を要約しています19,20。これには、以前に報告された方法と比較して、腎臓オルガノイドの形成に関与する4つの前駆細胞集団すべてを同時に作製できるという利点があります。さらに、これらのオルガノイドには、ヒトの腎臓に存在する主要な構造が含まれています。細胞機能を評価するという文脈では、細胞の正しい頂端/側底極性が集合体で主張できないため、オルガノイドを目的の化合物に曝露して細胞の取り込みを評価することには問題があると主張されています15。しかし、これらの細胞が抽出され、正しい極性が形成される方法で 2D プラットフォームに配置されたらどうなるでしょうか?

ヒト胚性幹細胞 (hESC)21、hPSC、および hiPSC22 を近位尿細管様細胞に直接分化させる方法が報告され、いくつかの応用が確立されていますが、一般的なコンセンサスは、次のような in vivo のような条件が欠如しているということです。 ECM がパフォーマンスが最適化されない原因です23。

この問題に取り組むために、いくつかの研究では、これらの細胞を初代細胞などの他の種類の細胞と混合するというアイデアが提唱されています。たとえば、最近 Beauchamp et al. HiPSC 心筋細胞 (hiPSC-CM) と心臓線維芽細胞を共培養すると、純粋な iPSC-CM よりも自発拍動活動が延長され、収縮の頻度と振幅が改善されることが示されました 24。 α-SMA 発現の結果的な損失は、共培養におけるより心臓組織のようなパターンを示しました。もちろん、電気刺激など、腎細胞には適用できない可能性のある他の広く使用されているアプローチもあります25。

ここで、近位尿細管上皮は、hiPSC 由来の腎臓オルガノイドから抽出された細胞を使用して、近位尿細管オンチップ (PToC) と呼ばれる微小生理学的システム上に形成されました。免疫磁気細胞分離 (MACS) によって分離された細胞は、近位尿細管特異的タンパク質およびその遺伝子発現に対する免疫染色によって証明されるように、近位尿細管由来でした。しかし、培養すると、これらのマーカーの発現レベルはmRNAレベルとタンパク質レベルの両方で大幅に低下するため、オルガノイド由来細胞が適切に機能する可能性については疑問が残されています。さらに、選別された細胞はオルガノイドニッチを回収する傾向があり、凝集体を形成し始めたため、マイクロ流体チップ膜上の組織の濾過性能を評価することが不可能になりました。我々は、そのような凝集が不死化近位尿細管細胞と1:1の比率で共培養すると大幅に減少する可能性があることを確立しました。私たちが知る限り、2 つの類似した細胞型 (1 つは不死化された細胞、もう 1 つは hiPSC 由来オルガノイドから得られたもの) を共培養するという概念はまだ研究されていません。

現在までに、薬物スクリーニングおよび近位尿細管の濾過機能を模倣するために、かなりの量の 2D マイクロ流体モデルと 3D バイオプリントモデルが開発されてきました 3,4,5,6,7。 3D モデルは細胞外マトリックス内に埋め込まれているため、生体内ニッチを再現できるため優れているという議論があります。しかし、私たちの知る限り、そのような利点を明らかにするための定量的な分析は行われていません。このプロジェクトでは、以前に報告された 3D バイオプリントモデルよりも狭い上皮/内皮間隙を持つ 2D 組織二重層を形成することにより、従来の見解を再検討する予定です7。最終的に、我々は、排出トランスポーターである P 糖タンパク質 (Pgp) の機能とともに、アルブミンとグルコースの再吸収と細胞排出プロセスのスループットを評価し、HUVEC との短時間の接触でも濾過速度が大幅に向上することを実証しました。

3D 自己組織化と腎形成は、前駆細胞混合物を収集し、トランスウェルフィルター上でペレット化した後、7 日目に始まります (図 1a)。オルガノイドには、22 日目に最適な割合および状態の近位尿細管細胞が含まれていることが確立されました。EpCAM+ 集団 (腎尿細管) は、刷子縁マーカーであるロータステトラゴノロバスレクチン (LTL)、より具体的には標識された近位尿細管細胞のスーパーセットとして同定されました。アルブミントランスポーターであるメガリンによるものです（図1b）。以前の推定によれば、オルガノイドにはおおよそ 20 ～ 30% の近位尿細管細胞が含まれています 19。オルガノイドの 3D 共焦点再構成が表示されます (補足ムービー 1 および 2)。

a hiPSC の中間中胚葉への分化と 3D 腎臓オルガノイドの形成、その後の解離、選別、および選別された細胞の播種の簡略化されたプロトコル。解離したオルガノイド、LTL + および LTL- は、それぞれ解離したオルガノイド細胞、MACS の陽性画分、および MACS の陰性画分を指します。 b 22日目の腎臓オルガノイドの明視野および共焦点蛍光画像（投影されたz強度）を選択します。免疫化学は、EpCAMおよび近位尿細管マーカー、LTLおよびメガリンに対するものです。 c MACS の特異性に対する LTL 濃度（希釈倍率 1/50 または 1/100）の影響、N = 4 実験、エラーバーはデータの標準偏差を表します、*p < 0.05。 d 選別され、培養皿およびPToCで7日間培養された細胞から得られた相対遺伝子発現レベル：オルガノイド、22日目の解離オルガノイド細胞。 LTL+/–、MACS 製品の陽性/陰性の割合。白色の領域は、解離したままの細胞（オルガノイド）および選別した細胞から得られたサンプルに対応し、灰色の領域は、7日間培養した細胞からのサンプルを示します。エラーバーは、N = 3 の生物学的に独立した実験での標準偏差を表します。 NS、p > 0.05 では有意ではない。 *p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001。 e 膜上で培養されたLTL+細胞の凝集体への進化、スケールバー、200μm。黄色の枠は細胞集合体と単層の境界を示します。スケールバー、200μm。 f 腎臓オルガノイドから抽出され、PToC に播種された選別された細胞における、近位尿細管のマーカーである EpCAM、LTL、およびメガリンの 7 日目の免疫化学。 LTL+組織の場合、(e)に示すように、凝集体の近くの選択された部分で蛍光スキャンを実行しました。スケールバー、50μm。

22日目に、オルガノイドは細胞懸濁液に解離されました。最適な抗体濃度を決定した後、懸濁液を部分的に LTL に曝露し、MACS に供しました (図 1c)。（詳細については、「方法」セクションおよび補足表1も参照してください。）また、高度な特異性についてFACSを検査し、分類および培養された製品の特徴を調べました（補足図1、2および補足データ1）。しかし、最終的には、初代近位尿細管細胞と十分に類似した表現型特徴を持つ細胞を生成する能力のため、MACS の使用を進めました (補足ムービー 3 ～ 6)。続いて、MACS 産物の陽性画分と陰性画分を収集し、残りの細胞懸濁液とともに 2D 条件で 7 日間培養するか、溶解して選別しました。ネフロンの近位尿細管コンパートメントがオルガノイドに存在するかどうかを確認し、2D 培養の効果を調べるために、多数の関連遺伝子に対して mRNA 解析を実施しました。

我々は、近位尿細管前駆細胞の特異的マーカーである CDH6 (K-カドヘリン) の発現レベル 16,26,27 が培養中に増加する一方、その増加は陰性画分 (LTL-) でより顕著であることを発見しました。すなわち、増加は、LTL+およびLTL-集団でそれぞれ2.2倍と6.2倍でした（図1d）。対照的に、2D 環境は、発現レベルが低下した (ABCB1、CUBN、LRP2、SLC3A1、およびおそらく SLC12A1) か完全に減少した (SLC22A6 (OAT1)) ため、調べた残りのマーカーにとって好ましくありませんでした。

チップ内で培養されたLTL +細胞から培養された組織（補足図3a、b）は凝集し始め、膜上に小さな回転楕円体状の凝集体を形成しました（図1e）。それにもかかわらず、免疫染色により、これらの細胞中に近位尿細管タンパク質が豊富に存在することが確認された。 EpCAM、LTL、およびメガリンは、ゆっくりと形成され、D7頃に識別できるようになったLTL +細胞凝集体においてのみ、高いコントラストで現れました（図1f）。 LTL-組織層には凝集体は観察されませんでした（補足図3c）。

MACS 後、LTL+ 画分と LTL- 画分の両方を収集し、107 細胞 mL-1 で培養しました。さらに、各画分と不死化腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC/TERT1細胞、以下RPTECと呼ぶ）との50：50共培養を調べた（図2a）。明視野画像（図2b）に示されているように、LTL+細胞はオルガノイドニッチを回復し、凝集し始めました。しかし、RPTEC細胞と共培養すると平らになり、バリア機能を研究できるようになりました。 LTL+ 細胞と RPTEC 細胞がよく混合し、コンフルエントな層を形成し、EpCAM に対して陽性であることが明らかになりました (図 2c)。対照的に、混合物中の LTL- 細胞はクラスター化されていましたが、合体して連続組織を形成できませんでした。以下、ＬＴＬ＋／ＲＰＴＥＣ上皮層を共培養物と呼ぶ。頂端から基底側に向けられた共焦点レーザースキャンは、頂端（LTL、ZO-1、およびPgp）および側底側（EpCAM）近位尿細管マーカーの発現を示します（補足ムービー7〜9）。

共培養アッセイを示すタイムライン (日単位)。先に概説したように、hiPSC を共培養の 23 日前にプレーティングし、続いて RPTEC を –5 日目に継代培養します。腎臓オルガノイドは成熟時に採取され、解離され、RPTEC と等量混合されます。次に、細胞混合物がチップに導入されます。 b LTL+および共培養組織の経時的進化を示す明視野画像。陽性画分のみの細胞は〜D4から凝集し始め、D7までに分離可能な回転楕円体を形成し（赤い矢印で示す）、このデバイスは濾過評価には実用的ではなくなります。一方、RPTEC との共培養では剥離は観察されません。スケールバー、200μm。 c D7の免疫染色サンプルから撮影したZ強度投影蛍光画像。 DAPI、F-アクチン、EpCAM はそれぞれ青、黄、緑で表されます。 RPTEC と 50/50 の比率で共培養すると、LTL+ 細胞はよく混ざり、コンフルエントな組織層を形成します。ただし、LTL- 画分を RPTEC と共培養しても、コンフルエントな組織層は得られません。白い矢印で示されているように、組織が部分的に剥離します。 EpCAM はこの組織全体でわずかに発現しており、主に RPTEC で発現しています。灰色の破線は、PToC メンブレンの場所を示します。スケールバー、200μm。 d D14の共培養組織の蛍光画像、明視野画像、および結合画像。上の行は、チャネル全体が RPTEC と LTL+ セルで均等にカバーされていることを示しています。最下段の高倍率写真は、混合物中の解離/選別された細胞が小さな凝集体を形成するだけでなく、共培養組織全体にほぼ均一に分布していることを明らかにしています。スケールバーは、上の列と下の列にそれぞれ 1 mm と 100 μm です。破線は目を誘導するためのものです。

予備試験では、選別された細胞の追跡を容易にするために、GFP 陽性 hiPSC をオルガノイドの培養に使用しました。共培養組織では、両方の細胞タイプが層全体にわたってその等角性を維持していることが明らかになりました。上皮の約50％に存在するオルガノイド由来細胞が識別可能です（図2d）。 14日目までに凝集体は共培養物に同化したが、一部のクラスターはまだ残っていた。この段階で、組織は特徴付けの準備ができているとみなされました。

どうやら、刷子縁マーカーは、RPTEC よりも腎臓オルガノイド由来 LTL+ 細胞でより強く発現されます。また、共培養組織では、LTL抗体が強く発現される場所ではラミニンとコラーゲンIVの両方が高密度に出現するため、LTL+細胞がRPTECの近くで独自のECMを分泌することも観察されました。共培養における Pgp の強力な発現は、外因性物質の除去能力の向上を示唆している可能性があります。 (図3a)。

a 14日目の単層RPTECおよび共培養組織層におけるLTL、ラミニン-111（α1β1γ1）ヘテロ三量体、コラーゲンIV、およびPgpの免疫組織化学。後者における両方のECMタンパク質の増強が強調されています。ラミニンおよびコラーゲンに結合したクラスターは、形態学的に生体内での膵島上皮クラスターに似ており、白と緑の矢印で示すように、主にオルガノイドから選別された LTL+ 細胞の周囲に現れます。同じことが近位尿細管の頂端タンパク質である Pgp にも当てはまります。スケールバー、30μm。 b D7 には LTL+ 細胞クラスターの周囲に、D14 には共培養組織全体に密着結合が出現。 (a) と (b) では、写真のペアは同じサンプルから取得され、スケールバーは 30 μm です。 c RPTECのみおよび共培養組織層の培養時間に伴う経上皮電気抵抗（TEER）の進化。共培養系では、おそらく混合物中の LTL+ 細胞が小さいため、抵抗はより急激に増加し、2 つの最初のプラトー (薄緑色の矢印) に達します。 2 番目のプラトー (濃い緑色の矢印) は、RPTEC のみのシステムで抵抗が飽和するのとほぼ同時に発生し、混合物中の RPTEC の寄与 (水色の矢印) に対応します。 TEER は、RPTEC のみの組織の最終定常状態値に正規化されます。 RPTEC のみの場合と共培養の場合、それぞれ N = 3 と 2 の独立した実験。 d D7およびD14の共培養単層における密着結合（暗赤色の矢印）の出現と確立を強調するTEM顕微鏡写真。スケールバー、1 μm。 V、液胞。 e メガリンおよびラミニン 111 の免疫細胞化学は、流れ誘発せん断応力によって引き起こされる共培養における両方のタンパク質の発現強度と分布の改善を示しています。スケールバー、50 μm (f) 共培養システムからの代表的な細胞の TEM 顕微鏡写真は、静置培養と灌流培養の条件を比較します。後者では、平らな単層（膜のほぼ全領域を覆う）、細胞突出を伴う単層、および前から前へ（頂端-頂端）の細胞スタックなど、さまざまな上皮組織形態の形成が明らかになります。 TEM 顕微鏡写真はすべて、D14 に固定された細胞のものです。スケールバーは、静的 (上) および灌流 (下) 状態を表す顕微鏡写真の 2 μm および 6 μm をそれぞれ表します。 M、ミトコンドリア。 N、核。 mem、PET膜。 g 14日目の共培養システムにおける微絨毛の長さ/密度および細胞の高さの定量化。絨毛密度は、個々のスナップショットから測定された突起の数を細胞膜の断面周囲の長さで割ったものとして定義されます。流れ誘起せん断応力は、より長くより密な微絨毛の成長を明らかにしただけでなく、扁平上皮から立方体への形態変換を証明するより高い細胞の成長も明らかにした。すべてのサンプルは D14 にあります。定量化の目的で、条件ごとに合計 N = 3 回の独立した TEM 実験から、n = 6、5、および 24 個の細胞がランダムに選択され、それぞれ絨毛の長さ、絨毛密度、細胞の高さを測定しました。エラーバーはデータの標準偏差を表します。

LTL+ 細胞と RPTEC を組み合わせた相乗効果は、密着結合タンパク質の強力な出現によっても証明されています。 ZO-1は、共培養ではD7の初期に現れ（図3b）、図3cのTEERプロファイルで観察された最初のプラトーに対応します。これらのプロットでは、実線と破線はそれぞれ RPTEC と共培養の場合の TEER 傾向の平滑化推定を表します。最初のプラトーは共培養の早い時期に発生し (薄緑色の矢印で示す)、接触阻害期間が短いことを示しています。 LTL+ 細胞は平均して小さく、より急峻な対数位相を示します。耐性は 14 日目あたりに収束し、共培養 (濃緑色の矢印) は RPTEC 組織 (薄青色の矢印) よりもわずかに耐性が高くなります。タイトジャンクションは TEM 画像でも視覚化されます (図 3d)。私たちのTEER測定戦略とセットアップは以前に報告されています28、29。明るい視野画像は、TEERチップ上の組織培養層の経時的進化を示しています（補足図3d）。 D14で輸送測定を行う前に、上皮層の明確なバリア機能が検証されました（補足図3e）。

機械的刺激の考えられる影響を実証および定量化するために、組織の頂端側を流れ誘発せん断応力にさらしました。組織培養に対する培地の流れの影響は 2 つあります。停滞状態とは対照的に、流れは成長因子やホルモンなどの培地の重要な成分を補充するのに役立つだけでなく、下にある組織にせん断応力を加えます。これら 2 つの効果は、腎臓の微小生理学的システムの文献ではほとんど区別されていません。ここでも静置培養条件で培地を循環させましたが、培地成分の供給を維持しながらせん断応力が無視できる程度になるように、微小流量（1 μL min-1）で循環させました。このようにして、内皮の先端側に対する機械的刺激の影響を明確に識別し、研究することができました。近位尿細管細胞は、一定範囲内のせん断刺激に応答することが知られています。近位尿細管に沿った連続せん断応力は、生体内で 0.1 から 1 ダイン cm-2 以上まで変化すると測定されています 30,31。ただし、尿細管糸球体のフィードバックにより、尿細管への瞬間的な流れはスムーズではなく、拍動的になる可能性があります 32。一定の速度では、脈動流の方が刺激が強いと予想されます。

以前にロングら。細胞の分化、増殖、およびある程度のエンドサイトーシスが、より低いせん断応力レベルで強化されることを観察しました 33。灌流培地条件では、培地を毎分 10 μL の速度で循環させた結果、平均せん断応力は 0.06 ダイン cm-2 となり、これは in vitro で報告されている最小値に近い値でした。その結果、蠕動ポンプの瞬間的に脈動する性質（補足図4a、b）が、ここで観察された細胞の形態と機能の改善に役割を果たしている可能性があると推測できました。免疫染色により、このような少量のせん断応力でさえ、共培養および非 iPSC 二重層システムの成熟上皮におけるメガリンの強度と分布に顕著な影響を与えることが明らかになりました。

さまざまな形態学的および機能的要因が改善されました。アルブミンの共輸送体であるメガリンはサイトゾルに再分布し、ラミニン分泌が改善されたことは明らかです（図3e）。電子顕微鏡検査でも、細胞の形態における重大な変化が明らかになった。刷子縁構造を持つ成熟近位尿細管細胞の特徴とは別に、共培養細胞では空胞とミトコンドリアが豊富な領域が観察されました。わずか 3 日間流動培地に曝露された細胞は、扁平上皮から立方体への表現型変化を示す頂端および基底表面の減少を受けました (図 3f)34,35。また、多数の TEM 画像を分析することで、これらの幾何学的変化の一部を定量化することもできました。図3gのグラフに示されているように、共培養細胞はより高く成長し、より長くより密な微絨毛を発達させました。このような定量化の目的では、単層内の細胞のみを数え、層状細胞を含む組織の小さな部分は無視しました。

どちらの細胞源と比較しても、共培養上皮では特定の重要な遺伝子のmRNA発現レベルが上昇しました（図4a）。しかし、免疫染色によって明らかなように、これらのレベルと対応するマーカーのタンパク質発現レベルとの間に不一致が観察されました。たとえば、ABCB1 は RPTEC サンプルと共培養組織サンプルでほぼ同じレベルで発現しましたが、Pgp は後者でより豊富に見つかりました。グルコーストランスポーターとアルブミントランスポーターである SGLT2 と LRP2 は、それぞれ mRNA レベルとタンパク質レベルが上昇しました。驚くべきことに、LRP2 は 100 倍以上増加しました。

a RPTEC/LTL+ 共培養における特定の遺伝子の発現レベルは、各コンポーネントの発現レベルよりも向上しています。機能的、ABCB1 (MDR1)、AQP1、LRP2、SLC22A2 (OCT2)、SLC5A2 (SGLT2)、および構造的、CDH6 (K-カドヘリン) および EpCAM、相対的な遺伝子発現レベル (対 ACTB レベル) には、相対的な遺伝子発現レベルが伴います。量（RPTEC組織の値に正規化）。 ABCB1 と EpCAM を除いて、他の遺伝子の発現レベルは共培養組織で有意に増加しました。 mRNA 発現レベルに悪影響はありませんでした。 RPTEC/LTL+ 単培養および共培養の場合、それぞれ N = 2 および 5 の生物学的に独立した実験。エラーバーはデータの標準偏差を表します。グルコースの再吸収率 (b) および Rh123 への見かけの透過率 (Papp) (c) は、静的および灌流培養条件にさらされた RPTEC のみおよび共培養組織層の両方について D14 に測定されました。すべてのケースでベクトル転送が検証されます。転送速度は、時間経過データに対して線形回帰を実行することによって推定されました。 a → b、頂端から基底へ。 b → a、基部から頂端まで。測定値は少なくとも N = 3 個の独立したチップから取得されます。エラーバーは平均値の SD を表します。 NS、p > 0.05 では有意ではない。 *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001。

我々は、トランスポータータンパク質レベルのこのような増加が能動的な経上皮輸送の改善につながる可能性があると仮説を立てました。私たちの仮説を検証するために、SGLT2 と Pgp 活性の尺度として、それぞれグルコースの再吸収速度とローダミン 123 (Rh123) の排泄速度を定量化しました。共培養におけるグルコースの頂端から基底への（a→b）輸送速度は、静置培養条件および灌流培養条件におけるRPTECのみの単層のそれよりもそれぞれ約1.75倍および2.50倍改善されたことを示しました（図4b）。調べた 4 つの条件すべての中で、基板の a → b 転写速度は逆 (b → a) 方向の転写速度よりも大幅に高かったものの、逆方向の転写速度には大きな変化はありませんでした。どちらの観察も、グルコース輸送のベクトル的性質を裏付けています。

Pgp 基質 Rh123 に対する見かけの透過率 (Papp) を図 4c に示します。排泄速度 (b → a) は吸収速度 (a → b) よりも高いため、検討した 4 つのケースすべてで輸送は一方向です。さらに、吸収速度に対する排泄速度の比として定義される基質の流出比は、静置培養条件下の共培養システムで 90% 増加し、生体異物沈着能力の大幅な改善が確認されました。

完全に分離された近位尿細管上皮チャネルと尿細管周囲内皮チャネルを作成するために、HUVEC の導入前に完全に密閉された RPTEC 組織が形成されるようにプロトコルを適合させました (図 5a)。これにより、HUVECの剥離を引き起こすEGM2とREGMの混合が防止されただけでなく（補足図4c、d）、成熟した近位尿細管上皮組織に対する内皮細胞の影響を研究することもできました。播種する前に、細胞接着剤のみで膜の両側をコーティングし、細胞が独自の ECM を分泌できるようにしました。外部 ECM タンパク質は適用されませんでしたが、二重層は少なくとも 10 日間安全に維持され、その後 HUVEC が剥離し始めました (補足図 4e および補足ムービー 10 および 11)。

a 一般的な細胞播種およびメンテナンスプロセスのスケジュール。 HUVEC は単層デバイスには含まれません。 b RPTECのみ（青い丸）、二重層（赤い四角）、およびHUVECのみ（緑の三角）組織層の報告された抵抗の時間経過。二層デバイスの場合、HUVEC が D10 に導入されると、全体の抵抗は融合内皮層の形成時に急上昇し、その後低下し始め、D14/d4 に定常状態に達します。破線は、各ケースの培養の最後の 4 日間で得られた平均抵抗性 (色付きのバー) を示します。すべての測定値は、定常状態、つまり 60 Ω cm2 (青い破線) での RPTEC TEER の値に正規化されています。緑と赤の両矢印は、報告されている HUVEC のみの層の抵抗と、RPTEC のみの組織に HUVEC を添加したときに測定された抵抗の増加をそれぞれ示します。 D14/d4 では安定した二重層が形成されます。 RPTECはN = 6のデバイスで培養され、そのうちN = 3はD10にHUVECを添加すると二重層になりました。 N = 3 のデバイスが HUVEC のみの組織専用でした。 c二重層系のRPTEC組織におけるZO-1、EpCAM、メガリンの免疫組織化学と、対応するRFPタグ付きHUVECの蛍光画像。それぞれ密着結合の進化、再上皮化の程度、アルブミントランスポーターの分布を示しています。。組織の活性と完全性は、D14/d4 と D17/d7 の間にピークになります。スケールバー、50μm。 d ZO-1発現の強度に対するHUVECの影響。 HUVEC の存在下では、密着結合は D14/d4 以降 (緑の矢印) に出現し、D17/d7 にははっきりと見えるようになりましたが、HUVEC の非存在下では、かなり高い共焦点レーザー透過率であっても、密着結合はかすかに現れました。この実験では Triton X は使用されませんでした。スケールバーは100μmです。すべての蛍光画像は共焦点の Z 強度で投影されます。スケールバー、100μm。

単層共培養システムと同様に、培養の全過程を通じて間隔を置いて RPTEC/HUVEC システムの全体的な電気抵抗を調査しました。単層RPTECおよびHUVEC組織を備えたデバイスを比較に使用し、すべての値を培養の最後の4日間に測定した平均RPTEC TEER、つまり60Ωcm2に対してスケールしました（図5b）。全体的な抵抗は、D10/d0 から D13/d3 までのコンフルエントな HUVEC 単層の形成中にオーバーシュートし、その後 d4 を過ぎると横ばいになります。ただし、図5bの赤い矢印で示されているように、二重層の作成時の抵抗ジャンプの振幅は、HUVECのみの組織の抵抗（緑色の矢印）と大きく異なりません。その結果、培養中の二重層抵抗プロファイルは安定しているように見えますが、HUVEC の導入が RPTEC 層の経上皮抵抗に大きな影響を与えた可能性は低いです。通常、RPTEC 単層培養物は約 0.1 ～ 1 kΩ cm2 の TEER を示します 36,37 が、生体内での近位尿細管組織は一桁小さい値を示すことが知られています。 in vivo での組織のバリア機能の漏洩は、より高度な細胞間輸送または傍細胞輸送によるものであるとよく議論されています 38。どうやら、そしておそらく同じ理由で、ここで測定された数十Ω cm2 の抵抗値は、生体内での RPTEC 単層と近位尿細管組織について以前に報告された値の間にあります。その後、HUVEC が実際にそのような改善に役割を果たしていることを証明します。

RPTEC が内皮細胞と共培養されるとパラクリンシグナル伝達ネットワークが形成され、RPTEC の増殖速度と分化の向上につながることが十分に確立されています 39。私たちの場合、HUVECとRPTECの間の相互作用およびそのようなシグナル伝達の証拠は、二重層形成のd4から識別できました。我々は、HUVECの存在下では、上皮組織の完全性とおそらく機能の両方が、EpCAM/ZO-1の揺るぎない出現と、細胞表面上で最大限に分散された（均一に分布した）メガリンの発現によって証明されるように、二重層形成の4日目と7日目の間のどこかでピークに達することを観察した。ｄ７（図５ｃ）。メガリンは移動性のアルブミントランスポーターであるため、培地中にすでに存在するアルブミンの細胞質への送達が改善されると考えられます。

これは、両方の細胞型がほぼ同時に集まったいくつかの以前の報告とは対照的に、10 日間の培養後でも近位尿細管組織の完全性と機能の改善が観察されているため、注目に値します。断面透過型電子顕微鏡（TEM）で観察されたように、PET膜の幅3μmの細孔が、これら2つの細胞型が通信できる唯一の可能なチャネルでした（補足図3b）。実際、約 5% の空隙率で十分な細胞間接触を確立するには十分でした。さらに、RPTECタイトジャンクションタンパク質の発現レベルは、以前のレポート6と同様に二重層系で明らかに増加しており（図5d）、その出現頻度も増加しています。その結果、細胞ソースに関係なく、すべての特性評価と機能評価は上皮層培養の D14 を中心に行われました。 ZO-1 は、D14 の共培養組織では鮮明に発現しましたが、同じ培養条件の RPTEC のみの単層システムではかすかに発現していることに注目してください。 RPTEC/HUVEC 二重層システムは、共培養組織と同程度の精査を受けました。

我々は、広範な免疫蛍光観察を実施することにより、特定の近位尿細管特異的タンパク質の時空間的発現パターンを推定した。簡単に言うと、いくつかの抗体の発現レベルを表す蛍光強度が、細胞を含む膜全体で撮影された共焦点画像のスタックを分析することによって定量化されました。この手順は、RPTEC / HUVEC二重層の代表的な断面蛍光画像と対応する強度プロファイルを使用して説明されています（図6a、b）。 Δdは、核の位置の尺度として、各抗体のピーク発現レベルの位置とDAPIのピーク発現レベルの位置との間の距離を示す。 Δd の値を培養日数に対してプロットすることにより、上皮層におけるタンパク質の運動性を追跡することができました。

a メガリンに対して免疫染色された RPTEC/HUVEC 二重層システムの選択された断面蛍光共焦点画像。核の中心から測定された対象タンパク質 (メガリンなど) の相対距離の定義を示します。スケールバーは10μmです。 b Δz (ピッチ) 200 nm、0.1 cm2のレーザー走査領域全体にわたるさまざまなマーカーの発光強度を平均することによって得られた蛍光シグナルの代表的なz強度プロファイル。（c）メガリン、（d）LTL、および（e）SGLT2の静的および灌流培養条件下で得られたRPTEC（二重層）の近位尿細管特異的マーカーから核までの平均距離。 N = 2 個の独立したチップを使用して、それぞれから n = 3 個のランダムな測定を行いました。エラーバーは標準偏差を示します。データペア間の統計的に有意な差は、p ≤ 0.05、0.01、0.001、および 0.0001 の場合、それぞれアスタリスク *、**、***、**** で示されます。選択した断面 TEM 画像は、D14/d4 のさまざまな培養条件における RPTEC の頂端膜の外観を強調表示します：（f）静的下の単層、（g）静的下の二重層、および（h）灌流培養条件下の単層。 (i) の拡大 TEM では、灌流培養下で 2 つの隣接する RPTEC 間に形成された密着結合 (黄色の矢印) が明らかになります。 j 膜の反対側にある HUVEC。スケールバーは2μmです。すべての顕微鏡写真は、D14/d4 に固定された細胞のものです。 M、ミトコンドリア。 N、核。 V、液胞。 mem、PET 膜、矢印は密着結合を指し、破線は細胞間の境界を示します。 k 微絨毛の長さ/密度およびRPTECの高さの定量化。絨毛密度は、個々のスナップショットから測定された突起の数を細胞膜の断面周囲の長さで割ったものとして定義されます。 RPTEC/HUVEC は D14/d4 にあります。明らかに、HUVEC の近くにある RPTEC は、より高密度の頂端微絨毛を発達させ、その結果、より高い表面積をもたらしました。さらに、微絨毛の密度分布は二重層構造の方が狭くなります。静置培養条件では、単層症例と二層症例の間で絨毛の長さに有意な差は観察されなかった。流れによって引き起こされるせん断応力は、より長く現れるだけでなく、微絨毛のより大きな密度も現れました。定量化の目的で、条件ごとに合計 N = 3 の独立した TEM 観察から、単層 (静的)、二層 (静的)、および単層 (流動) 培養条件から n = 9、5、および 5 枚の RPTEC 顕微鏡写真をランダムに選択しました。、それぞれ絨毛の長さと密度を測定します。細胞の高さを測定するために、静的条件と流動条件についてそれぞれ n = 8 および n = 9 の顕微鏡写真を検査しました。エラーバーはデータの標準偏差を表します。 l RPTECのみの組織とフロー培養条件下で開発された共培養組織について示された、核からの基底タンパク質と頂端タンパク質の平均距離。蛍光画像の Z 強度プロファイリングによって得られたデータ。統計は (c–e) と同様の方法で導出されます。

メガリンの場合、核から遠くに見えるほど、頂端膜に結合する可能性が高くなります。つまり、不活性状態のままです。二重層システムでは、HUVECが最初に播種されると、最初に頂端膜で発現されるメガリンが、7日間のRPTEC培養中に内部移行されることに気づきました（補足図5a）。一方、RPTECが最初に播種される場合、RPTECはD14に細胞内環境に完全に取り込まれ、エンドサイトーシス活性のピークが示唆されます（図6cおよび補足図5b）40。本明細書に提示されるデータおよび図３ｅの蛍光画像は、灌流がメガリンの活性を増加させるだけでなく、細胞質ゾル中のメガリンの存在量も増加させることを明らかにしている。このような改善は、アルブミンの再吸収率の向上に反映されます。流体せん断応力下での細胞の高さ/コンパクトさの増加に関する以前の報告31と一致して、ここでのタンパク質プロファイリングによって、頂端マーカーであるLTLおよびSGLT2が核からより遠くに見えることがわかりました（図6d、e）。

14日目の上層の細胞の断面電子顕微鏡検査により、非iPSC上皮に対するせん断応力とHUVECとの近接性の独特の影響も明らかになりました（図6f-j）。自己分泌された ECM 成分は膜孔を通って拡散し、HUVEC との連絡経路を提供します。 3D 管状構造と比較して細胞は扁平上皮状であったにもかかわらず 5、7、密着結合は明確に識別できました。密着結合の観察は、RPTEC のみおよび RPTEC/LTL+ 共培養上皮の両方の不浸透性を確認し、細胞内輸送の評価を検証するために不可欠です。 RPTEC のみの組織における密着結合は、共培養単層系における密着結合よりも遅い段階で形成され始めました。また、統計的に確認されていませんが、灌流培養下でより緊密になるようです（補足図6）。

上皮細胞の起源に関係なく、絨毛の密度と長さ、および細胞の高さはすべて、せん断応力の影響下で増加し、生体内状態と似ていました。興味深いことに、機械的刺激がない場合でも、HUVECと接触しているRPTEC上にはより高密度の絨毛が現れました（図6k）。より大きく高密度の絨毛集団は、より効率的なエンドサイトーシスとトランスサイトーシスを示します。

D14に、単層RPTECのみおよび共培養システムにおける核からの基底（ラミニンおよびコラーゲンIV）、頂端下（ZO-1）、および頂端（Pgp）タンパク質の平均相対距離を測定しました（図6l）。 ECMと頂端タンパク質は共培養組織の核からより遠くで発現するため、共培養組織の近位尿細管細胞は平均してより高く成長したと考えられる。間違いなく、RPTEC 組織は膜全体でより均一な厚さを持ち、細胞の配向と分極の集合的な度合いはより高くなります (Pgp および ZO-1 のエラーバーはより小さくなります)。また、RPTEC のみの組織では、ZO-1 が頂端 Pgp の下で明らかに発現していることにも注目してください。個々の細胞の TEM 観察に基づく細胞の高さの定量化では、図 6l に示されているものとまったく同じ結果は得られませんでした。ただし、傾向は同様でした。我々は、PET 膜が平らではないために、頂点マーカーと基底マーカーの間で測定された平均相対距離が短くなる Z 強度プロファイリングのプロセスに矛盾が生じると考えています。さらに、頂端タンパク質は必ずしも細胞のピーク上で発現するとは限らないため、膜から細胞頂点までの細胞の高さを測定すると、より大きな値が得られます。細胞の高さに対するせん断応力の影響は共培養でより顕著であったと述べました。つまり、RPTECのみの組織では37%増加したのに対し、共培養では99%増加しました（図3gおよび図6kの細胞高さ）。

RPTEC/HUVEC二重層の形成プロトコルを再び図7aに示します。 HUVEC の存在が近位尿細管の構造および機能のマーカーに影響を与えるかどうかを判断するために、qPCR 分析を実施しました。微絨毛頂端膜で観察された形態学的改善とは別に、我々は、特定のRPTEC遺伝子のmRNAレベルが、流動誘発せん断応力下およびHUVECの存在下で増加することに気づきました。一方では、AQP1、EpCAM、MDR1、OCT2、およびおそらくSGLT2は、灌流流にさらされた成熟二重層系で上方制御され、他方では、培地灌流下のHUVECの近傍では、AQP1、EpCAM、MDR1、およびおそらくSGLT2の発現レベルが引き起こされています。 OCT2 は増加します (図 7b)。

a PToC を使用した腎臓の再吸収と排泄の定量化のための一般的なプロトコル。測定は、手持ちのアッセイや組織層の構成に関係なく、14 日目に開始します。上皮マイクロチャネルと血管系マイクロチャネルの両方の培地は、高分子基質 (BSA-AF488 など) の拡散を改善するために循環されます。移動速度（アルブミン/グルコースの再吸収またはRh123への見かけの透過性）は、時間経過データに対して線形回帰を行うことによって推定されました。 b 構造遺伝子、CDH6 (K-カドヘリン) および EpCAM、および機能遺伝子、すなわち ABCB1 (MDR1)、AQP1、SLC22A2 (OCT2)、SLC5A2 (SGLT2) の相対発現レベル (対 ACTB) とRPTEC のみおよび RPTEC/HUVEC システムの ACTB 遺伝子。 4 つのグループ、すなわち (i) 培養皿の D14 上の RPTEC が提示されます。 (ii)、静置培養条件下での二重層の RPTEC。 (iii)、灌流培養条件下での二重層の RPTEC。 (iv) 灌流培地下の単層 RPTEC。培地灌流下での HUVEC との近接により、AQP1、EpCAM、MDR1、OCT2、および SGLT2 の発現レベルが増加しました (グループ iii とグループ iv を比較)。独立して、灌流は共培養物中の同じ遺伝子 (SGLT2 を除く) の発現レベルを増加させました (グループ ii と iii を比較)。 1 セットの実験から得られた各遺伝子/サンプルについて、n = 5 の PCR 複製を分析しました。 c 静的および灌流培養条件で測定されたグルコースプローブ、2NBDG の移動速度。再吸収 (a → b) と逆移動速度 (b → a) の両方が定量化されました。グルコース輸送に対するフロリジン (P.) の阻害効果も調べられました。 n = 3 個の独立したチップ。 d 排泄（b→a）方向と逆（a→b）方向の両方におけるRh123に対する見かけの透過性。 Rh123 排出の候補であるベラパミル (V.) は、Rh123 流出を弱め、Pgp の機能を確認するために適用されました。 N = 3 個の独立したチップ。 e 二層構成および単層構成のRPTEC組織層の蛍光共焦点zスタック画像。かなり多量の BSA が二重層系の RPTEC の側底環境で沈殿し、基質の摂取量が多いことを示しました。一部の BSA は、D17 上の単層 RPTEC 内に沈殿します (白い矢印)。スケールバーは50μmです。 f 両方向における AF488 結合ウシ血清アルブミン (BSA-AF488) の輸送速度。この研究では、BSA-AF488 の選択的輸送に対するインキュベーション温度の低下 (4 °C へ) の影響を調べました。最小 N = 6 個の独立したチップ。（b〜d、f）では、示されているように、2サンプルのt検定がデータセットのペア間で実行されました。エラーバーは標準偏差を表します。 ND、検出されません。該当なし、利用できません。 NS、重要ではありません。 *、**、***、**** (p ≤ 0.05、0.01、0.001、0.0001 の場合)。 a → b、頂端から基底へ。 b→a、基部から先端まで。

したがって、HUVEC に近接させた上皮は、より緻密な構造を示すだけでなく、より高い生体異物除去速度とグルコース取り込み速度を示す可能性があると我々は予想しました。これらの仮定は、グルコース再吸収およびRh123排泄速度の詳細な評価によって確認され、SGLT2およびMDR1に対応するタンパク質（SGLT2およびPgp）のレベルも同様に強化されたことが示されました（図7c、d）。 a → b グルコース再吸収速度は、HUVEC の存在下および灌流下で独立して大幅に改善されましたが、b → a 速度はほとんど変化しませんでした。また、SGLT1 と SGLT241、42、43 の両方の古典的な競合阻害剤としてのフロリジンは、グルコースの再吸収を効果的にブロックしました。

LRP2 は安定的に検出されませんでしたが、アルブミン再吸収率を分析することにより、RPTEC におけるメガリンの存在と適切な機能が確認されました。我々は、RPTEC のアルブミン取り込み能力が HUVEC の存在下で大幅に増加することを示しました。これは、二重層システムのRPTECの側底側におけるBSAの蓄積によって証明されています（図7e）。さらに、二重層はアルブミン a → b トランスサイトーシスのより高い割合を示しました (図 7f)。以前に調査したように、測定中の温度を下げると、再吸収率が大幅に低下したようです44,45。

これらの結果は、直感的には、内皮層がチャネルを横切る生体分子の移動を妨げる可能性があるにもかかわらず、特に再吸収および排泄速度が増加するため、興味深いものです。 2 つの細胞型間のパラクリンシグナル伝達により、メガリン、SGLT2、および Pgp の機能が改善され、グルコース、アルブミン、および Rh123 がすべて二重層組織を介してかなり高い速度で移動されるようになりました。さらに、機械的刺激がない場合でも、HUVECと共培養したRPTECでは、頂端微絨毛がより高密度になりました（図5k）。 RPTEC/HUVEC 二重層システムでは、Rh123 の全体的な流出比に目に見える改善は見られませんでしたが、グルコースとアルブミンの再吸収速度は両方とも増加したことに注目してください。最後に、単層および二層システムにおける側底生体異物輸送体である OCT2 の能力を評価しました。 OCT2 は、薬物誘発性腎障害を引き起こすことが知られているオキサリプラチンやシスプラチンなどの化学療法薬の取り込みを担っています 46。 OCT2阻害剤としてシメチジンを使用して、カチオン性蛍光EtBrの選択的取り込みと4-Di-1-ASP（ASP+）のベクトル取り込みを示しました（両方ともOCT2基質として知られています）（補足図7）。ただし、HUVEC が二重層内の輸送速度を向上させることが証明されたアルブミン、グルコース、および Rh123 濾過アッセイとは対照的に、RPTEC 単層は基質が HUVEC によってブロックされるため、ASP+ の吸収においてより効率的でした。

我々は、hiPSC 由来腎臓オルガノイド (LTL+) から抽出した細胞と分化したヒト RTPEC/TERT1 細胞を組み合わせることによる 2D 近位尿細管組織の操作を報告します。人工的に作られた組織層は、非 iPSC ベースの組織層と比較して、濾過/再吸収能力が向上しました。さらに、特定の近位尿細管特異的遺伝子の mRNA 発現レベルが共培養で増幅され、より高い成熟度および機能を示しました。我々の人工上皮は、完全に融合した腎臓オルガノイド由来細胞と不死化細胞で構成されており、少なくとも14日目まではその形状を安定に維持することができた。

プロトコルで概説されているように、中間の中胚葉分化中に、後腎間葉と尿管上皮前駆細胞の比率は、CHIR から FGF9 への切り替えの日を選択することによって調整できます19。切り替え日が遅くなると、前者がより多く生成され、キャップ間充織が生じ、より多くのネフロンが生成されます。私たちは単に近位尿細管様細胞を採取することに興味があるので、切り替えの遅い日 (5 日目) を選択しました。以前に報告された、2D 培養後に観察された K-カドヘリンの発現レベルの大幅な増加は、近位尿細管前駆細胞として知られる CDH6 高、LTL 低細胞の増殖速度が、より高い細胞と比較して高いことに起因すると考えられます。成熟した CDH6 が低く、LTL が高い分化した集団 47。

並行して、我々は、PET膜上に発達した成熟した接触阻害された近位尿細管上皮層の特性と性能に対する内皮細胞と流れ誘発せん断応力の影響を調べて強調することにより、2D近位尿細管モデルに関する文献を再検討しました。 HUVEC は、密着結合の強度と出現頻度、AQP1、EpCAM、OCT2、MDR1、および SGLT2 の mRNA レベル、およびそれぞれの基質、グルコース、および Rh123 のベクトル輸送速度を大幅に向上させることが確立されました。補足表 2 および 3 は、RPTEC のみの場合と比較した、二重層および共培養システムにおけるグルコース取り込み率と Rh123 流出比の改善をまとめたものです。 LTL+ 細胞とは対照的に、RPTEC では LRP2 は検出されませんでした (またはごく微量で検出されただけであり)、以前の研究が裏付けられました 15。しかし、灌流流量によって量を調節できるメガリンは豊富に発現した。また、アルブミン輸送速度を実証および測定しました。ここで得られる速度は生体内での場合よりもはるかに低いですが、物質移動の大部分が膜によって妨げられていることは明らかです。

私たちの知る限り、hiPSC ベースの腎臓オルガノイドに由来する近位尿細管細胞を独立して組み込んだこれまでの研究はありません。また、hiPSC 腎臓オルガノイド由来の上皮細胞を不死化細胞株と共培養することによって 2D 機能組織を構築しようとした者もいません。他の研究者は、iPSC の分化誘導によって近位尿細管様細胞を生成し、特徴付けています。最初に中間中胚葉 (IM) の細胞を生成し、次に IM 細胞を腎細胞に送り込みます 15。これらの分化プロトコルにより、腎臓発生の初期段階に似た細胞クラスターが生成され、最長 7 日間安定でした。 CDH6 や LRP2 などの典型的なマーカーは、本明細書で検討したのと同様のパターンで mRNA レベルを発現することが検出されましたが、ABCB1 の痕跡はありませんでした。それどころか、LTL+ 細胞では低レベルで遺伝子が検出されました。 RPTEC と共培養組織の間で ABCB1 の発現レベルに大きな差は観察されませんでしたが、共培養ではタンパク質レベルと活性が大幅に向上しました。したがって、我々は、Pgp タンパク質/活性が必ずしもその遺伝子発現レベルに従うわけではないという考えに同意し、確認します。この以前の研究では、競合的な Pgp 阻害剤であるシクロスポリン A (CsA) の存在下でのカルセイン AM の蓄積を示すことによって Pgp の機能が定性的に実証されましたが、流出速度などの定量的な輸送データは調査されていませんでした。

私たちは、私たちの共培養システムが既存の近位尿細管上皮モデルに比べていくつかの利点を提供すると信じています。たとえば、関連する患者由来の iPSC を組み込んでオルガノイドを形成することで、患者固有の疾患モデリング、薬剤スクリーニング、病因研究が可能になります。次に、これらのオルガノイドに、ここで概説したのと同じ手順を適用して、細胞株と共培養できる罹患細胞を取得し、最終的に分析および治療目的で均質な組織を形成することができます。さらに、iPSC 由来のオルガノイドから得られた細胞を不死化細胞と混合して ECM の分泌を促進または促進し、2D 機能組織を形成するという概念は、組織工学における遍在的な応用を提供する可能性があります。

細胞選別実験中に、プロトコールにわずかな変更を加えることで、特に陽性画分の回収効率を最適化できることに気づきました。複数のオルガノイドから解離した生細胞の数のばらつきは、MACS の成功率に顕著な影響を与えましたが、これは抗体の濃度を調整することで対処できました。半 iPSC ベースの組織が競合組織よりも迅速に上皮バリアを形成するという事実は、当社の堅牢な 4 プローブ TEER 測定技術によって実証されました。腎臓オルガノイドを生成するためのプロトコルの選択は無計画ではありませんでした。我々が腎臓オルガノイドから iPSC 由来細胞を抽出するという概念を提唱した当時、TakaSat et al.19 が提案したプロトコールにより、最も複雑な hiPSC 由来腎臓オルガノイドが生成されました。その後のこの分野の進歩により、おそらくより複雑なネフロン構造を持つ腎臓オルガノイドが実証されました14。

PET膜は二重層を通過する輸送を大幅に妨げますが、さまざまな条件で輸送速度を定量化し、関連する古典的な阻害剤によってそれぞれを調節する能力を備えたアルブミン、グルコース、およびRh123のベクトル輸送を実証することができました。膜を介した十分な上皮-内皮クロストークにより、組織の完全性（密着結合）、頂端微絨毛の密度が向上し、特にトランスポーター、MDR1、OCT2、およびSGLT2の遺伝子発現レベルが向上しました。

私たちの方法と以前のプロトコル6,7の主な違いは、内皮細胞を方程式に導入する前に、すでに成熟した（接触阻害された）上皮近位尿細管層を形成/調査する戦略です。さらに、細胞が独自の ECM を分泌できるように、膜に追加の (人工) ECM コーティングを適用することは控えました。組織構築物は、マイクロ流体チップにおける共培養の特性評価および関連する再吸収/濾過速度の定量分析を容易にするために、意図的に平らな形状になるように意図されていました。

チップは、2つの同一のPDMSスラブと、間に挟まれた多孔質PET膜で構成されています（補足図3a）。それぞれ３．０μｍおよび５％の孔径および気孔率を有するＰＥＴ膜を、Ｆａｌｃｏｎ透過性支持体（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５３０９１）から切り取った。標準的な SU-8 フォトリソグラフィーを使用して形成されたエンボス加工されたマイクロ流体チャネルパターンを備えた 4 インチ Si(100) ウェハーの 1/4 上にスラブをレプリカ成形しました。簡単に説明すると、PDMS (Sylgard 184、Toray Dow Corning) と硬化剤の 10:1 混合物を注入しました。ペトリ皿に配置されたモールド上に. 硬化してモールドからスラブを取り外した後、メンブレンを取り付けて接着する 2 つの方法を検討しました. 最初のアプローチでは、未硬化の PDMS の非常に薄い層を底部スラブ上に回転させて、膜として機能させました。接着層の上にメンブレンを配置し、上部スラブをメンブレン上に置き、メンブレンで隔てられたマイクロ流体チャネルが完全に重なるように顕微鏡下で注意深く位置合わせした後、チップを65℃のオーブンで最終的に硬化させたこの方法では、硬化ステップの前にスラブを簡単かつ正確に位置合わせすることができましたが、高い硬化温度で膜が変形しました。さらに、未硬化の PDMS の一部がチャネル内に拡散し、利用可能な領域が減少しました。細胞培養用の膜。この方法で製造されたデバイスは、細胞培養や免疫染色などの予備検証実験に使用されました。 2 番目の方法では、接着層は適用されませんでした。簡単に説明すると、膜とマイクロチャネル側を上にした底部スラブをO2プラズマ(Covance-1MP、Femto Science Inc.)下で1分間処理して、表面を親水性にした。次いで、膜を底部スラブ上に配置した。次に、上部スラブと膜を有する下部スラブを O2 プラズマに 1 分間曝露しました。スラブを直ちに集めて、顕微鏡下で結合させた。このようにして、酸化された PDMS スラブは接触後に互いに強く結合するため、顕微鏡下でマイクロチャネルを位置合わせするワンショットのチャンスがありました。それにもかかわらず、すべてのプロセスが室温で行われたため、膜は完全に平坦なままでした。結合後、マイクロチャネルの両端のスラブに幅 2 mm の穴を開けました。一般に、膜のわずかな湾曲や見かけの面積の減少に起因する可能性のある、測定結果に大きな偏差は見られませんでした。ただし、輸送速度の定量化には室温で製造されたデバイスが使用されました。

hiPSC は、分化のために播種する前に 3 回継代されました。解凍後、3 つの継代すべてを 6 ウェルプレートに移しました。まずプレートを、ウェルあたり 1 mL DPBS で調製した iMatrix-511 (0.5 mg mL-1、Nippi、892011/892012) 3 μg mL-1 でコーティングしました (1/6)。プレートを37℃で1時間インキュベートした後、10μMのROCK阻害剤（Y27632、10mM、Wako、253-00511）を含むStemFit（味の素、AK02N）0.75mL（ウェルあたり）で満たし、再度インキュベートしました。 200 µL の幹細胞バンカーで凍結された未標識 hiPSC (ATCC CRL-1502 胎児線維芽細胞由来の雌 CRL1502-C32 線維芽細胞 48) または標識 hiPSC (H2B-GFP 統合 1502.3) 106 細胞 mL-1 を含むクライオバイアルを 37 ℃ の凍結バイアルで急速に解凍しました。 ℃の水浴。ワイドボアの 1 mL ピペットチップを使用して、細胞を 5 mL の StemFit を含む 5 mL エッペンドルフチューブに慎重に移しました。チューブを２００Ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引した後、細胞を100μLのStemFitに再懸濁し、計数した。 1.5 mL の細胞懸濁液を、104 個の細胞を含むように各ウェルごとに StemFit で調製し、iMatrix でコーティングされたウェルプレートに加えました。播種後、ウェル全体の均一な被覆を維持するためにプレートを室温に5分間保ち、その後37℃でインキュベートしました。継代の間および解離前に、細胞を DPBS (ウェルあたり 1 mL) で 2 回洗浄し、TrypLE (Fisher、12563-029) 0.3 mL に浸し、5 分間インキュベートし、1 回軽く叩いて撹拌し、再度 3 分間インキュベートしました。分。 1 mLのStemFitを加えて各ウェルから細胞を5 mLチューブに収集し、上記のようにiMatrixでコーティングしたウェルプレートにウェルあたり104細胞で再播種しました。 3 回の継代後、細胞は解離され、-1 日目に培養されました。参考文献に概説されているように、分化は0日目に開始されました。 19. 簡単に言うと、後部原条は、APEL でグリコーゲン合成酵素キナーゼ (GSK-3) 阻害剤 CHIR99021 を使用して、骨形成タンパク質 (BMP) と標準的な WNT シグナル伝達を活性化することによって誘導されました。中間中胚葉を誘導するために、5 日目に CHIR を FGF9 に切り替えました。 7日目に、トランスウェルフィルター上で凝集体を培養することによって3D自己組織化が開始されました。成長因子は12日目に中止されました。

継代数 9 未満で 106 細胞/バイアルで保存した凍結保存した不死化 RPTEC/TERT1 細胞 (ATCC® CRL-4031™) を解凍し、約 90% コンフルエントに達するまで T25 細胞培養フラスコで継代培養しました。 5 日間続く継代培養期間中、hTERT 不死化 RPTEC 増殖キット (ATCC® ACS4007™) を補充した DMEM/F12 (Gibco 11320033) をメーカーの指示に従って培地として使用しました。細胞をトリプシン処理し、REGM™ (Lonza CC-3190) に 4 × 106 細胞/mL で再懸濁しました。チップのマイクロチャネルとリザーバーを 70% エタノールで滅菌し、クリーンベンチで乾燥させ、UV 光に 1 時間曝露しました。播種する前に、メンブレンを細胞接着剤である FNC Coating Mix® (Athena 0407) でコーティングし、37 °C で 1 分間インキュベートして細胞接着速度を高めました。各デバイスの下部チャネルを 200 μL の REGM で満たした後、30 μL の細胞懸濁液を上部チャネルに静かに注入しました。 RPTEC が完全に沈降して膜に付着するまで、デバイスを 37 °C、5% CO2 で 1 時間インキュベートし、その後 170 μL の REGM を上部チャネルに添加しました。デバイスはインキュベーター内に維持され、両方のチャネルの培地が毎日更新される間、監視されました。

二重層を搭載するように指定されたチップ上で、RFP-HUVEC を 10 日目に膜の反対側で培養しました。簡単に説明すると、RFP 標識 HUVEC (Angio-Proteomie Co. cAP-0001RFP) を継代数付き 5 × 105 細胞/バイアルでストックしました4 つ未満を RPTEC と同様の方法で EGM2™ (Lonza CC-3162) で継代培養しました。コンフルエント(約90%)になったら、細胞をEGM2に4×106細胞/mLで再懸濁した。 REGM を吸引した後、30 μL の HUVEC 懸濁液を各デバイスの底部チャネルに静かに注入しました。デバイスをすぐに裏返し、内皮細胞が適切に接着するまで 2 時間インキュベートしました。次いで、デバイスを裏返し、170μLのEGM2を底部チャネルに添加した。以降、ＲＥＧＭとＥＧＭ２を毎日交換した。

当社は、37 °C、5% CO2 で動作し、6 台のデバイスを同時に処理できるカスタムメイドの灌流培養システムセットアップを設計しました。 RPTEC/HUVEC 培養の 11 日目/1 日目から開始し、それぞれ 3 mL を含む滅菌ガラス瓶からの REGM および EGM2 を、対応するマイクロチャネルを通して 10 μL min-1 または 1 μL min-1 で灌流して、以下の培養条件を模倣しました。それぞれ静的メディアと流動メディアです。 Q = 10 μL min-1 の流量で、上皮細胞の頂端膜にかかるせん断応力 τ は、次の式を使用して 0.06 dyn cm-2 と推定されました。

ここで、η = 0.7 は 37 °C でのおおよその媒体粘度、h = 0.35 mm と W = 1.0 mm はそれぞれチャネルの高さと幅です。ジャー内の培地全体を一日おきに交換した。

メンブレンの両側の細胞を、DPBS (1X) (Gibco®) 中の 4% パラホルムアルデヒドを両方のチャネルに 10 分間適用することによって固定し、特に記載がない限り、0.1% Triton X-100 で 10 分間透過処理し、その後、 10% ロバ血清のブロッキングバッファーで 1 時間、すべて室温で処理します。ブロッキングバッファーで調製した一次抗体の混合物を両方のマイクロチャネルに適用し、サンプルを 4 °C で一晩放置しました。翌日、膜をDPBSで3回、各30分間徹底的にリンスし、次にDPBS中で調製した二次抗体の混合物に室温で1時間浸漬した。次いで、膜をＤＡＰＩで１０分間処理し、続いて退色防止封入剤（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓ３６９３７）で処理し、顕微鏡スライド上に載せた。共焦点蛍光顕微鏡検査は、Olympus FV3000顕微鏡を用いて実施した。画像は、FV31S-SW (v2.5.1.228、Olympus) ビューアソフトウェアおよび Image J (v1.53f51、NIH、USA) によって分析されました。補足表 4 に、使用した抗体の濃度を示します。

チップ内の細胞を含む膜を最初に DPBS ですすぎ、2% グルタルアルデヒド (EM グレード、電子顕微鏡科学) と 0.1 M NaPO4 水溶液からなる緩衝液を用いて 4 °C で一晩固定し、続いて 2% OsO4 で後固定しました。 (Crystal、Heraeus Chemicals、南アフリカ) 氷浴中で 3 時間。チップは顕微鏡検査用に外注されました。施設に到着したら、標本を段階的エタノール (50、70、90、100、100、および 100%、それぞれ 15 分間) で脱水し、エポキシ樹脂に包埋しました。ウルトラミクロトーム技術により、極薄の 80 nm 切片を切断しました。酢酸ウラニルで 10 分間、鉛染色溶液で 5 分間染色した超薄切片を、HITACHI H-7600 で 100KV で分析しました。

RNA 単離キット (NucleoSpin® RNA) を使用して、条件ごとに 3 つの個別のサンプルから全 mRNA を抽出および精製しました。メーカーの指示に従って、PrimeScript™ RT Master Mix キットを使用した逆転写には、最大量 3 μg/60 μL の mRNA を使用しました。鋳型 cDNA サンプルを、TaqMan® Universal PCR Master Mix および TaqMan® Gene Expression Assay の対象遺伝子ごとのフォワードおよびリバースプライマーで希釈し (1:10)、384 マルチウェル反応プレートの 5 ウェルに分配しました。定量的 RT-PCR は、QuantStudio® 5 リアルタイム PCR 検出システム (ThermoFisher Scientific) を使用して実行されました。 β-アクチンを内因性遺伝子として使用した。プライマーデータは補足表 5 にリストされています。

高里らのプロトコールに従って、30 個の腎臓オルガノイド (KO) を調製しました。（2016年）。オルガノイドは誘導の D22 に採取され、製造業者の指示に従って腫瘍解離キット (Miltenyi Biotec、#130-095-929) に含まれる酵素を使用して解離されました。調製した三重酵素 H、R、および A を、それぞれ 4、2、および 0.5% (v/v) の濃度で分離バッファーに溶解しました。分離バッファーは、DPBS、2 mMのEDTA (Fisher、15575020)、および0.5% (v/v)のFBSで構成されていました。解離した細胞は、播種段階に至るまでの分離および選別プロセス全体を通じて同じバッファーに懸濁されました。 BD FACSAria™ III セルソーターを使用して選別を行い、選別された細胞を播種または mRNA 単離のために 10 μM の ROCK 阻害剤 (Fuji Film、CultureSure® Y-27632) を含む REGM に再懸濁しました。詳細については、補足図 1、2 を参照してください。

各実験について、16 個の KO を準備しました。オルガノイドは誘導の D22 ～ 26 の間に採取され、FACS と同様の方法で解離され、分離バッファーに懸濁され、選別前の全プロセスを通して氷上で保存されました。サンプルを短時間遠心分離し、再懸濁し、2 つの等しい部分に分けました (1 部分あたり 8 KO)。各部分を 10 µm pluriStrainer® (pluriSelect、#43-50010-03) ふるいに通して、残っている細胞クラスターを除去しました。ふるいにかけた部分を再混合し、遠心分離し、分離緩衝液に再懸濁して、計数した。強力な近位尿細管刷子縁マーカーであるビオチン化ハステトラゴノロバスレクチン (LTL) を一次抗体として 1:100 の比率で懸濁液に適用しました。 4℃で30分間インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、再懸濁を2回行い、結合していない抗体を完全に除去しました。モノクローナル抗ビオチンマイクロビーズ (Miltenyi Biotec、#130-105-637) を 1:5 の比率で間接磁気標識に適用しました。次に、懸濁液を 4 °C で 30 分間インキュベートし、遠心分離し、分離バッファー (500 μL) に再懸濁しました。懸濁液を、OctoMACS セパレーター (Miltenyi Biotec、#130-042-108) の 8 つのスロットの 1 つに差し込まれた MS カラム (Miltenyi Biotec、#130-042-201) に静かに加えました。懸濁液を適用する前に、30 µm Pre-Separation フィルター (Miltenyi Biotec、#130-041-407) をカラムに配置して細孔を詰まらせる凝集塊を除去し、ピラー全体を 500 µL の DPBS で湿らせました。懸濁液を適用した後、カラムを 500 µL の分離バッファーで 2 回リンスし、ネガティブ画分 (LTL-) を完全に除去しました (総量 1.5 mL)。陽性画分 (LTL+) を収集するために、カラムをセパレーターから取り外し、収集チューブに置き、すぐに 1 mL の分離バッファーでフラッシュしました。 MACS 成功率とは、最終 MACS 生成物 (LTL+ および LTL- 細胞) の合計を、LTL マーカー、マイクロビーズにさらし、その後分離カラムに適用した濾過された生細胞 (< 10 μm) の総数で割ったものを指します。明らかに、抗体によるタグ付け中に細胞の 50% が失われました。最適化実験の過程で、細胞懸濁液中の LTL 抗体の協奏度を 1:50 から 1:100 に減少させることにより、特異性が 7% 増加することを確立しました。図 1c のチャートは、最終 MACS 製品の相対集団を LTL 抗体濃度の関数として示しています。補足表 1 は、MACS プロセスの統計を示します。データは 7 回の連続実験から収集されます。最後に、播種または mRNA 単離のために、両方の画分を 10 μM ROCK 阻害剤を含む REGM に再懸濁しました。

AF488 結合 BSA (ThermoFisher、A13100) の少量アリコートを 5 mg mL-1 で調製し、使用するまで -30 °C で保存しました。自家製灌流システムを使用して、組織構成 (単層または二層) に関係なく、50 μg mL-1 の AF488 結合 BSA (ThermoFisher、A13100) および未使用の EGM2 を含む REGM 3 mL を、それぞれ上部チャネルと下部チャネルに循環させました。。培地を24時間灌流および循環させた。底部チャネルを供給するEGM2含有リザーバーから6時間間隔で10μLのサンプルを収集した。 EGM2 内の拡散物濃度は、分光光度計 (NanoDrop™ 3300) を使用して直ちに測定されました。 3 mL のソースから 10 μL の量を 4 回除去しても拡散平衡は乱されないと仮定されました。十分なアルブミン濃度勾配を維持するには、濃縮液チャネルと希釈液チャネルの両方で培地の循環が必要であることを確立しました。 BSA は分子量が高い (66 kDa) ため、静的な場合には極微量しか拡散できません (補足表 6)。基底から頂端への逆方向の移動も同様の方法で定量化しましたが、代わりに AF488 結合 BSA を下部チャネルに供給する EGM2 に溶解し、上部の未処理の REGM で測定しました。アルブミン再吸収に対する温度低下の阻害効果を評価するために、セットアップをインキュベーターの代わりに 4 °C の暗室に置きました。

2-NBD-グルコース、蛍光グルコース取り込みプローブ (2-NBDG、Abcam、ab1462002) のストック溶液を 30 mM で調製し、後で使用するために –30 °C で保存しました。メディアを洗い流した後、200 μL の DPBS+ (Gibco、14040133) を上部と下部のチャネルに適用し、デバイスを 37 °C で 30 分間浸しました。グルコース再吸収の測定は、上部チャネルの 100 μL の DPBS+ を同量の 1 mM 2-NBDG 溶液に置き換えて、最終濃度 0.5 mM を達成することによって開始しました。 1 時間間隔で、100 μL の容量を 2 回手動で循環 (ピペッティング) することにより、底部チャネルの拡散液を穏やかに、しかし徹底的に混合しました。同量をサンプリングし、暗色のエッペンドルフチューブに保存しました。枯渇した緩衝液は、100μLの新鮮なDPBS+を添加することによって直ちに補充された。サンプル濃度は、NanoDrop™ 3300 によってサンプリング間隔の間に測定されました。次の式を使用して、除去された量を反映することにより、各間隔で採取されたサンプルの濃度からグルコースの経時的濃度を計算しました。

ここで、Ct と Ct–1 はそれぞれ、現在および前のサンプリング時点でのチャネル内の 2-NDBG の実際の濃度を表し、Rt と Rt – 1 は対応するサンプル濃度をすべて nmol min–1 で表します。 200 μL と 100 μL の容量は、それぞれチャネルとサンプリングの合計容量を指します。速度は、0 ≤ t ≤ 3 時間にわたる濃度の経時変化データに対して線形回帰を実行することによって得られました。 SGLT 阻害は、フロリジンを投与することによって評価されました。フロリジン (P3449、Sigma) のアリコートを 70% エタノール中で 100 mM で調製し、後で使用するために –30 °C で保存しました。薬物を1000μMの濃度(100倍希釈)で適用した。グルコースのベクトルエキソサイトーシスを、逆方向、すなわち基底から頂端への物質移動速度を定量化することによって調べた。この場合、2-NBDG を下部チャネルに適用し、上部で測定しました。

我々は、2.5 μM で適用された Rh123 (Fisher、R302) の移動速度を測定することにより、Pgp 排出ポンプの性能を調べました。 Rh123 の流出を阻害するために、Rh123 候補としてベラパミルを 300 μM で添加しました。培養培地を除去し洗い流した後、上部および下部チャネルをそれぞれ200μLのHBSS pH 6およびHBSS pH 7.4で満たした。デバイスを 37 °C で 30 分間プレインキュベートしました。サンプリングは、グルコース再吸収測定手順と同様の方法で実行されました。ただし、流出（基部から先端へ）速度が望ましいため、基質は主に底部チャネルに適用され、上部で測定されました。簡単に言うと、ソース濃度を2.5μMに維持するために、底部チャネルからの緩衝液100μLを、ベラパミルを含む/または含まないHBSS pH 7.4中で調製したRh123の5μM溶液と置き換えた。 100μLのサンプルを上部チャネルから間隔を置いて収集し、黒色の底部96ウェルプレート(Corning、CLS3925)の個々のウェルに移した。マイクロプレートリーダーの製造元が推奨する 200 μL の作業容量を達成するために、各ウェルに HBSS を事前に充填しました。サンプリング直後に、上部チャネルに 100 μL の HBSS pH 6 を補充しました。サンプリングの前に、96 ウェルプレートの 1 列を既知濃度の Rh123 溶液で満たし、キャリブレーションデータを取得しました。サンプルの蛍光発光は、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices、SpectraMax® iD5) によって測定されました。逆方向の移動速度を定量化するために、Rh123 (ベラパミルありまたはなし) を HPSS pH 6 に溶解し、上部チャネルから投与しました。

すべての蛍光基質の校正データを補足表 7 に示します。

臭化エチジウム (EtBr) 取り込み実験では、対照サンプルは最上層で培養された HUVEC 単層のみから構成されていました。 Rh123 アッセイと同様の方法で、すべてのサンプルを酸性および中性の HBSS 緩衝液中でプレインキュベートしました。カチオン性蛍光プローブとして、2.5 μM の EtBr を下部チャネル (RPTEC の基底側) に、または 2.5 μM の 4-Di-1-ASP (ASP+) を頂端側と基底側に別々に導入しました。プローブの導入後、デバイスを 4 時間インキュベートしました。次に、RPTEC および HUVEC 単層を、EtBr および ASP+ 実験のそれぞれ 60 分および 30 分間隔で倒立蛍光顕微鏡を使用して画像化しました。 EtBr および ASP+ のトランスポーター依存性取り込みを検証するために、OCT2 阻害剤として 1 mM のシメチジンを同時に投与しました。サンプルの相対蛍光強度は、Image J ソフトウェアを使用して個々のスナップショットから計算され、阻害剤なしの RPTEC の相対蛍光強度に正規化されました。

測定は、カスタムメイドの 4 つのプローブのセットアップを使用してマイクロ流体チップで実行されました 28。簡単に言うと、RPTECまたはRPTEC/LTL+細胞混合物を、前述のように膜の上層で培養しました。細胞を含む膜のインピーダンスは、ＬＣＲメーター（ＺＭ２７３１、ＮＦ社）を使用し、２０ｍＶのピークツーピーク電圧下で１００Ｈｚから１０ｋＨｚの周波数範囲にわたる正弦波刺激で測定した。ベースラインインピーダンスはシード前に記録され、両方のチャネルが REGM で満たされました。 TEER 値は、測定された抵抗からベースライン抵抗を差し引くことによって得られました。すべての測定は、37 °C、5% CO2 のインキュベーター内で実行されました。 4 つのプローブ技術により、培地の直列抵抗と電極表面の電気二重層を除去できます。高速フーリエ変換 (FFT) ローパスフィルターを適用して、カットオフ周波数で TEER 曲線を滑らかにしました。

ウィンドウ値のポイントは n = 6、時間間隔は Δt = 0.5 日です。

一般に、特に明記されていない限り、測定データ (転送速度など) を収集するために、条件ごとに合計 N = 3 個の独立したデバイス (チップ) が使用されました。 2 つのデータグループ間の有意性を調べるために、有意水準を 0.05 に設定して 2 サンプル t 検定を実行しました。 RPTECおよびLTL+の場合にはN = 2の独立した実験しかなかったため、図4aのqPCRデータの統計的有意性分析を除外しました。補足情報（つまり、補足図1d、2b）に示されているqPCRデータは、n = 5の技術的複製を使用した条件ごとに1つの実験から収集されています。したがって、グループ間の統計分析は行われませんでした。その他の詳細については、図のキャプションで説明されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

グラフとチャートの数値ソースデータは https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22339615.v2 に保存されています。

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著者らは、TEM 顕微鏡検査に関する支援を行ったハナイチ超構造研究所に感謝します。また、腎臓オルガノイドのメンテナンス、逆転写、qPCR、微細加工実験にご協力いただいた森分真由美氏、亀田良和氏、森本志保氏、久保亜紀氏に感謝いたします。 MACS プロトコルの開発にご協力いただいた Yoshiki Sahara 氏に心より感謝いたします。本研究の一部は、文部科学省および科学技術振興機構のセンター・オブ・イノベーション・プログラム（COI）（助成金番号：JPMJCE1307）、AMED-MPS事業（助成金番号：JP22be1004204およびJP17be0304205）、および「ナノテクノロジープラットフォームプログラム」における京都大学ナノテクノロジーハブの支援を受けました。文部科学省（MEXT）による助成金（助成金番号：JPMXP09F19KT0107）。

京都大学大学院工学研究科マイクロ工学専攻、京都市、615-8540

Ramin Banan Sadeghian, Ryohei Ueno, Yuji Takata, Akihiko Kawakami, Cheng Ma & Ryuji Yokokawa

京都大学 iPS 細胞研究所 (CiRA)、京都市、606-8507

Toshikazu Araoka

理化学研究所生命機能科学研究センター (BDR)、神戸市、650-0047

Minoru Takasato

大阪大学大学院医学系研究科（〒565-0871 大阪市）

Minoru Takasato

京都大学大学院生命科学研究科, 京都市, 606-8501

Minoru Takasato

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RBS と RY はプロジェクトを考案、監督し、データを解釈し、原稿を執筆しました。 RBS は、細胞培養/維持、免疫染色、共焦点顕微鏡、画像解析、Z 強度プロファイリング、TEER 測定、qPCR、グルコースおよびアルブミン輸送アッセイ、チップ微細加工のためのプロトコルを確立し、実験を実施してデータを分析しました。 RU は、Pgp および OCT2 輸送アッセイを設計し、細胞培養を実施し、RPTEC/HUVEC 二重層システムで対応する測定を実施しました。 YT と RU は TEER 実験を設計し、実施しました。 KA は、RPTEC/LTL + 共培養システムで Pgp トランスポーターアッセイを実行しました。 CM は、流れによるせん断応力をモデル化するために使用されるチップの有限要素モデルを設計し、シミュレーションを実行しました。 MT は、hiPSC 由来 KO、MACS の培養と維持のためのプロトコルを提供し、データ解釈を支援しました。 TA は FACS のプロトコルを提供し、関連する分類実験とデータ分析を支援しました。著者全員が原稿を読み、編集し、コメントを加えました。

横川隆司氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Roberto Gramignoli と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Simona Chera、Eve Rogers、George Inglis。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Banan Sadeghian、R.、上野、R.、高田、Y. 他 hiPSC 由来の腎臓オルガノイドから選別された細胞と不死化細胞は、近位尿細管を確実にモデル化します。 Commun Biol 6、483 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

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受信日: 2022 年 9 月 19 日

受理日: 2023 年 4 月 21 日

公開日: 2023 年 5 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

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