合成細胞接着分子による多細胞集合体のプログラミング

Nature volume 614、pages 144–152 (2023)この記事を引用

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459 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞接着分子は多細胞生物のいたるところに存在し、組織発生、免疫細胞輸送、神経系の配線などの多様なプロセスにおける正確な細胞間相互作用を規定しています1、2、3、4。今回我々は、カドヘリンやインテグリンなどの天然接着分子の細胞内ドメインと直交する細胞外相互作用を組み合わせることで、幅広い合成細胞接着分子を生成できることを示す。得られた分子は、ネイティブな相互作用と同様の接着特性を備えた、カスタマイズされた細胞間相互作用をもたらします。合成細胞接着分子の細胞内ドメインの正体は界面の形態と機構を特定するのに対し、多様な同型または異型の細胞外相互作用ドメインは独立して細胞間の接続性を特定します。直交接着分子のこのツールキットにより、合理的にプログラムされた多細胞構造の構築と、天然組織の系統的なリモデリングが可能になります。合成細胞接着分子のモジュール性は、異なる種類の細胞間界面がどのように進化したかについての基本的な洞察を提供します。全体として、これらのツールは、細胞および組織工学、および多細胞組織の体系的な研究に強力な機能を提供します。

細胞間接着を体系的にプログラムできる機能は、発生、神経生物学、免疫学の研究に強力な新しいツールを提供し、多細胞組織の修復や治療用細胞の設計を容易にする可能性があります5、6（図1a）。それにもかかわらず、後生動物細胞における接着の工学的操作は、合成生物学において依然として研究されていない領域である。

a、細胞接着の多様な機能的役割。 b、synCAM受容体の概念設計。 CAMの細胞外ドメイン（左）は、GFPおよびGFP結合ナノボディ（抗GFP、右）によって置き換えられます。 ICD のないテザーコントロールも示されています (中央)。 c、ペアワイズ synCAM インターフェイスの ×20 共焦点顕微鏡画像の最大投影。スケールバー、10 μm。 t = 3 時間。 GFP 発現細胞 (青) は抗 GFP 発現細胞 (オレンジ) に結合します。各ペアの CAM TM および ICD ドメインが示されています (テザーは ICD を欠くコントロールです) (上)。下は、上記の界面の GFP チャネルであり、界面での受容体の濃縮の違いを強調しています。一致する synCAM 発現レベルを拡張データ図 1 に示します。d、a に示す界面から測定した接触角。 n = 20 (テザー)、n = 20 (WT ECAD)、n = 20 (DLL1)、n = 20 (JAM-B)、n = 20 (NCAM-1)、n = 20 (ICAM-1)、n = 20 (ECAD)、n = 20 (ITGB1)、n = 20 (ITGB2)、n = 15 (MUC4)。 WT ECAD 同型細胞間相互作用の接触角も示されています。 e、cからの細胞間界面でのGFP濃縮の割合。 n = 20 (テザー)、n = 20 (DLL1)、n = 20 (JAM-B)、n = 20 (NCAM-1)、n = 20 (ICAM-1)、n = 20 (ECAD)、n = 20 (ITGB1)、n = 20 (ITGB2)、n = 15 (MUC4)。 f、示された親和性を有するGFP/抗GFP synCAMを発現するペアワイズL929細胞の、ICAM-1 ICDの存在下(青)または非存在下(黒)の接触角の定量。 n = 20 ペア。エラーバーは 95% 信頼区間を示します。 t = 3 時間。一致した synCAM 発現レベルを拡張データ図 1 に示します。同じシリーズの親和性が変化した synCAM 細胞の代替解析 (競合セルソーティングアッセイ) を拡張データ図 3 に示します。d および e の箱ひげ図については、中心線は中央値を示し、ボックスの範囲は 25 ～ 75 パーセンタイルを示し、ひげは最小値から最大値を示します。

ソースデータ

ネイティブな細胞間相互作用は、細胞接着分子（CAM）の大規模な集合によって媒介されます。細胞接着分子（CAM）は、隣接する細胞またはマトリックスに結合し、多くの場合細胞骨格の再構成を伴う機械的接着反応を誘導する複合膜貫通タンパク質です7、8、9、10、11。 CAM の例には、接着斑を組み立てるインテグリンと、上皮細胞間の接着結合を組み立てるカドヘリンが含まれます 11、12、13、14。 CAM の構造の複雑さと機能の多様性により、細胞外結合機能と細胞内ドメイン媒介の細胞骨格再構成機能が分離および再結合して新しい細胞間接続を生成できるかどうかは不明ですが、以前の研究ではモジュール性の可能性が示されています 15、16、17。 18、19。

今回我々は、直交性細胞外結合ドメイン（ECD）を内在性CAM細胞内ドメイン（ICD）に融合させ、それによって合成CAM（synCAM）を生成することにより、CAMのモジュール性を系統的に探索する。私たちは、結果として生じる細胞間境界面を特徴づけ、synCAMが新しい多細胞組織をプログラムできるかどうかをテストします。

我々は、よく特徴付けられた直交結合相互作用であるGFP-抗GFP（ナノボディ）相互作用がE-カドヘリン（ECAD）、インテグリンβ1（ITGB1）、インテグリンβ2（ITGB2）、細胞間接着分子 1 (ICAM-1)、デルタ様タンパク質 1 (DLL1)、接合接着分子 B (JAM-B)、神経細胞接着分子 1 (NCAM-1) およびムチン 4 (MUC-4)20 (図.1b)。ドナーCAMからの膜貫通領域(TM)およびICDをGFPまたは抗GFP ECDに融合させた。

次に、対称的に一致する ICD と組み合わせた同族 synCAM が、L929 マウス線維芽細胞 (カドヘリンの示差接着選別を評価するために使用される内因性接着が低い細胞株) 間の結合形成を促進できるかどうかをテストしました 21,22。同族synCAMを発現する細胞を平底超低付着（ULA）プレート内で混合し、共焦点顕微鏡を使用して画像化しました（図1c）。我々は、synCAM駆動インターフェースを、天然接着分子（野生型（WT）ECADなど）または単純なテザー（ICDを欠く膜貫通ドメインに融合したGFPまたは抗GFP）によって形成されるインターフェースと比較しました。 synCAM/テザーは発現が一致しました (拡張データ図 1)。

いくつかの synCAM (ICD: ECAD、ITGB1、ITGB2、ICAM-1、および MUC-4) は、天然カドヘリンで観察されるものと同等の広範な界面を形成しました。これらの分子には大きな天然の細胞外ドメインが完全に欠如しているにもかかわらず、天然のような界面が形成されます。対照的に、テザー (ICD なし) は広範な界面を形成せず、小さな接触点のみが示されました。

他のいくつかの synCAM (ICD: NCAM-1、JAM-B、および DLL1) は、異なる表現型を示しました。得られた界面は小さいですが、GFP標識synCAMの界面がかなり豊富でした（図1c）。対照的に、係留された細胞ペアの GFP シグナルは膜全体に分布したままでした。したがって、これらの synCAM は、関与すると界面での強化された空間クラスタリングの明確な表現型を駆動します。

synCAM相互作用（15〜20細胞ペア）の界面形状を定量的に分析するために、接触角（界面サイズと相関する見かけの細胞間表面張力の標準指標）を測定しました23、24、25（図1d）。また、濃縮画分（膜全体に対する界面に局在するGFPタグ付きsynCAMの画分；図1e）も測定しました。これらの結果は、synCAM の 2 つの主要な表現型クラスを示しています。1 つのクラスは、大きく広範囲にわたる細胞間境界面 (ICD: ECAD、ITGB1、ITGB2、および ICAM-1、MUC-4) の形成を誘導し、もう 1 つのクラスは、小さな領域の形成を誘導します。ただし、高度に強化されたインターフェイス (ICD: NCAM-1、JAM-B、および DLL1) (MUC-4 と ICAM-1 はハイブリッド動作を示します)。これらの synCAM インターフェイスクラスはそれぞれ、単純なテザー相互作用とは異なります。

強力な ECD 結合相互作用と細胞骨格との強力な ICD カップリングの両方が、緊密な細胞間界面の形成に寄与している可能性があります。 synCAM のモジュール性により、インターフェイス強度に対する相対的な ECD および ICD の寄与を調査できます。 ICAM-1 synCAMをテストベッドシステムとして使用し、さまざまなECD親和性（GFPナノボディの親和性シリーズを使用）または欠失ICD20を使用して細胞間界面を特徴付けました（図1fおよび拡張データ図1）。 ECD 親和性を解離定数 (Kd) 0.7 nM から 3 μM (>103 倍) に下げると、結果として生じる細胞間接触角は徐々に減少しますが、最も弱い ECD であっても界面は大幅に拡大します。対照的に、ICAM-1 ICD を欠失させると、高親和性 ECD が存在する場合でも、界面が完全に破壊されます。 ECD Kd が 0.7 nM から 110 nM の間で変化した場合、ITGB1 ICD を備えた synCAM についても、細胞間接触角の同様の緩やかな減少が観察されました (拡張データ図 2)。これらの観察は、ICD によって媒介される細胞機械的変化が界面の強度と形態の決定に主要な役割を果たしているというモデルと一致しています 23,24。

また、ECD 相互作用親和性の低下が NCAM-1 synCAM の界面濃縮表現型にどのような影響を与えるかを特徴付けました。 ECD 親和性が Kd = 0.7 nM ～ 600 nM の範囲で変化した場合でも、GFP 受容体は界面で高度に濃縮されたままです (拡張データ図 2)。したがって、濃縮されたインターフェース表現型も、主に ICD のアイデンティティによって駆動されるようです。

接着特性の決定における ECD 親和性に対する ICD の優位性は、競合選別アッセイで裏付けられました (拡張データ図 3)。ここでは、2 つの異なる抗 GFP synCAM (ICAM-1 ICD) バリアントを発現する細胞が、GFP synCAM の「ベイト」細胞と共選別するために競合します。親和性の高い細胞は、ベイト細胞とともに細胞クラスターの中心に優先的に選別されます。この相補的アッセイは、ICD が主に接着の好みを決定することも示しています。 GFP-ICAM-1/anti-GFP-ICAM-1 の高レベル発現も接触角を増加させました (拡張データ図 4)。対照的に、GFP/抗GFPテザーの発現量が高くても接触角は変化しませんでした。

synCAMインターフェースをより詳細に調べるために、抗GFP synCAMを発現するL929細胞がGFPでコーティングされた表面と相互作用する、より制御されたアッセイを使用しました（図2および拡張データ図5a）。ここで、表面 GFP は動かず、再配置できないため、相互作用する synCAM 細胞が表面に広がります。 75分後、細胞を固定し、ファロイジンで染色して、アクチン細胞骨格を観察しました。単純な抗GFP-テザー相互作用により、GFP表面上での細胞の広がりが最小限に抑えられました（図2a）。しかし、synCAM は再び 2 つの異なる拡散モードを示しました。 ICAM-1、ITGB1、ITGB2、およびECADのICDを備えたsynCAMを発現する細胞は、GFP表面上で均一に増殖し、細胞周囲に沿って皮質アクチンの密なバンドを発達させました（図2b）。速度論的研究では、この大きな拡散には数十分から数時間の遅い段階があり、細胞骨格のリモデリングの要件と一致していることが示されています（拡張データ図5b-e）。これらの synCAM は、セルの全周に沿って均一な「拡張性」の広がりを生成します。対照的に、MUC-4、NCAM-1、およびJAM-B ICDを備えたsynCAMは、「目玉焼き」形態をもたらしました。つまり、より小さな中央の細胞塊が周囲の薄い膜の突起に囲まれていました（図2c）。これらの場合、葉状仮足および/または糸状仮足のアクチン構造が放射状に「突出する」広がりを媒介しました。全体として、これらの表面拡散研究は、我々の以前の細胞間界面研究と一致している。なぜなら、拡張的に拡散するsynCAMはより大きな細胞間界面とより大きな接触角をもたらす一方、突出拡散するsynCAMは小さいながらも高度に濃縮された界面を形成するからである。

a〜c、GFPでコーティングされた表面上に広がる、示されたsynCAMを発現するL929細胞の代表的なファロイジン染色画像。スケールバー、10 μm。 t = 2 時間。アクチン (ファロイジン染色) は緑色で表示されます。細胞の完全なフットプリント (膜ラベル) は紫色で表示されます。すべての画像は同じ縮尺で表示されます。 a、抗 GFP テザーを発現する L929 細胞 (ICD なし) は最小限の広がりを示します。 b、ECAD、ICAM-1、ITGB1、およびITGB2のICDを含むsynCAMを発現するL929細胞は、拡大拡散表現型を示します。細胞は、細胞フットプリントの周囲に皮質アクチンを伴って円形に広がります。拡張データの拡散動態アッセイを参照してください。図 5.c、NCAM-1、JAM-B、および MUC-4 の ICD を備えた synCAM を発現する L929 細胞は、突出性拡散表現型 (「目玉焼き」形状) を示しますが、皮質アクチンはそうではありません。非常に遠くまで広がりますが、細胞膜のフットプリントは細胞を超えて非常に薄い層に広がり、多くの場合円形度が低くなります（つまり、本質的に糸状仮足または葉状仮足のような性質があります）。 d、synCAM媒介細胞拡散の細胞の全フットプリント（青色）と細胞領域（灰色）。箱ひげ図の場合、中心線は中央値を示し、箱の範囲は 25 ～ 75 パーセンタイルを示し、ひげは最小値から最大値を示します。セル領域: n = 23 (テザー)、n = 17 (ECAD)、n = 23 (JAM-B)、n = 16 (ICAM-1)、n = 16 (ITGB1)、n = 18 (ITGB2)、n = 14 (NCAM-1)、n = 12 (MUC-4)。セルのフットプリント: n = 22 (テザー)、n = 21 (ECAD)、n = 19 (JAM-B)、n = 23 (ICAM-1)、n = 16 (ITGB1)、n = 12 (ITGB2)、n = 14 (NCAM-1)、n = 15 (MUC-4)。 e, CAM ICD で見られる下流の細胞内タンパク質の既知のリクルート相互作用。拡張データ図 6 の ICD 結合モチーフの変異解析を参照してください。

ソースデータ

我々は、synCAM駆動による細胞拡散が、異なるアクチン制御因子の一連の小分子阻害剤によってどのように変化するかを調査した（拡張データ図6a）。すべての synCAM 発現細胞は、アクチンフィラメント形成を破壊するラトランキュリン B の存在下で最小限の拡散を示し、細胞拡散のすべてのモードにおける細胞骨格活性の重要性が確認されました。対照的に、ブレビスタチンで収縮性を阻害すると（それでもアクチンの重合は可能ですが）、synCAM細胞の拡散が可能になりましたが、アクチンの異なるsynCAMに特有の異なる構造への集合を制御することはできませんでした。この結果は、細胞が新しい界面を伸長する際の、伸長と皮質収縮性との間の競合を強調する 24,26 。突起状に広がる synCAM (JAM-B ICD など) の場合、細胞の周縁部に通常見られる葉状仮足シートが CK666 によって破壊されます。これは、これらの薄い突起状の形成におけるその標的である ARP2/3 複合体の役割を示しています。構造物。

ここで観察された明確な界面形態は、CAM ICDの仮定されたメカニズムによって説明できます（図2e）。詳細は個々に異なりますが、拡張型 ICD (ECAD、ICAM-1、インテグリン) は、β-カテニン、タリン、ビンキュリン、ERM タンパク質などのアダプター分子を動員します。これらのタンパク質は、皮質アクチン細胞骨格に関与し、したがって細胞骨格の拡張を促進すると考えられています。セルフロント全体12、13、27。対照的に、突出型 ICD (NCAM-1、JAM-B、DLL1) は PDZ 足場タンパク質または脂質ラフトと相互作用し、一般にクラスター化または相凝縮を伴う組織化された複合体を形成します 28、29、30、31。結果として得られる空間的に集中した集合体は、N-WASPやARP2/3などのタンパク質を動員して活性化することにより、糸状仮足や葉状仮足の形成などの突出性細胞骨格反応を駆動する可能性があります。界面形成におけるこれらのICD相互作用ドメインの重要性は、主要なシグナル伝達モチーフの変異分析によって確認されました（拡張データ図6b-h）。

多くの内因性 CAM (ECAD や JAM-B など) は同種親和的に結合し、対称 ICD との界面を形成します。ただし、他の多くの内因性 CAM (ITGB1、ITGB2、ICAM-1 など) は異好性相互作用に関与し、異なる反対側の ICD との細胞間境界面を形成します。したがって、我々は synCAM プラットフォームを使用して、対称 ICD と非対称 ICD が細胞間界面の形態にどのような影響を与えるかを調査しました。我々は、L929線維芽細胞における異なるGFP-anti-GFP synCAMの考えられるすべてのペアを調べました（図3および拡張データ図7）。

a、ペアワイズ synCAM インターフェースの ×20 共焦点顕微鏡画像の最大投影 (t = 3 時間)、対称 ECAD ICD (左)、非対称 ECAD およびテザー (ΔICD) インターフェース (中央)、およびバランスのとれた非対称 ECAD および ICAM-1 を示しています。インターフェース（右）。スケールバー、10 μm。 3 つの独立した複製にわたる 10 ペアからの代表的な画像の mCherry および BFP チャネル (上) と GFP チャネル (下) が示されています。 b、ペアワイズ非対称 synCAM インターフェースの接触角 (上) と GFP 濃縮 (下) の定量化。 n = 10。最大の接触角または濃縮を示す界面の組み合わせは、赤で囲まれています。 c、突出型synCAMが拡張型synCAMに結合するペアワイズ不均衡な非対称界面の20倍の共焦点顕微鏡画像の例。 t = 3 時間。スケールバー、10 μm。 3 つの独立した複製にわたる 10 対の代表的な画像が表示されます。上、突出型抗 GFP synCAM と拡張型 GFP synCAM の間の結合。下は、突出型GFP synCAMと拡張型抗GFP synCAMの間の結合。

ソースデータ

界面の片側に完全に削除されたICD（テザー）を備えた非対称界面は、著しく破壊された界面を示します。それらは、最小限の細胞間界面の拡大と接触角の増加を示します（図3a、b）。ただし、2 つの拡張 synCAM (たとえば、ECAD – ICAM-1 または ECAD – ITGB2) を組み合わせる場合、大規模な非対称インターフェイスを形成できます (図 3a、b)。これらの発見は、反対側の ICD がバランスの取れた相互作用を生み出す場合、大きく拡張された界面が非対称 synCAM と形成される可能性があることを示唆しています。同様に、両方とも GFP 濃縮を媒介する 2 つの ICD を組み合わせた非対称界面（たとえば、NCAM-1 – MUC-4、NCAM-1 – JAM-B）は、対称界面の表現型と同様の界面濃縮表現型を生成します（図 3a、 b）。したがって、生産的な界面を形成するには、対向する ICD の正確な配列は、強度と形態が一致する ICD の存在ほど重要ではありません。

注目すべきことに、突出型synCAMを持つ細胞が拡張型synCAMを持つ細胞に結合する異型界面を作成したところ、細胞は一貫した形態で相互作用し、突出型synCAM細胞が拡張型synCAM細胞を包み込む非対称界面を形成した(図3c)。これらの結果は、synCAM の組み合わせで構築できるインターフェイスの多様性を示しています。

新しい多細胞組織の形成を新たにプログラムするには、多細胞システム内の特定の細胞接続を決定する必要があります5、32、33。細菌系と哺乳類系の両方において、多細胞集合を直交的に制御するこれまでの取り組みでは、一般的に表面テザリングアプローチが使用されてきた5、32、33、34、35。特に、最近の研究により、直交するナノボディと抗原のペアの表面発現を通じて、遺伝子操作された細菌のカスタムパターン化が可能になりました 33。細胞形態と細胞骨格構造を指示する synCAM の能力を考慮して、特定の空間接続性も合理的にプログラムするために、広範囲の直交 ECD を使用して synCAM を操作できるかどうかをテストしました。私たちは、機能的な synCAM が、HA タグ – 抗 HA 一本鎖可変フラグメント (scFv) を含む、複数の異なる抗体 – 抗原結合ペアで構築できることを発見しました。マルトース結合タンパク質 (MBP) – 抗 MBP ナノボディ。 B 細胞表面抗原 CD19 – 抗 CD19 scFv。チロシンプロテインキナーゼ MET – 抗 MET ナノボディ。 mCherry – 抗 mCherry ナノボディ。および上皮成長因子受容体（EGFR）-抗EGFRナノボディ（図4aおよび補足ビデオ1）。異なる ECD synCAM の直交性は共選別アッセイを使用して確認され、多細胞集合体から WT L929 細胞を除外する効率を定量化しました (拡張データ図 8)。

a、直交する細胞外認識ドメインを有する異好性synCAM。示された抗体抗原ペア ECD および ICAM-1 (上) または ITGB1 (下) TM/ICD のいずれかを含む synCAM を発現する L929 細胞の、20 倍の共焦点顕微鏡細胞間界面画像の最大投影が示されています。スケールバー、10 μm。 t = 3 時間。 4 つの独立した複製の代表的な画像が示されています。直交ソートの実験的テストは、拡張データ図 8 に示されています。直交アセンブリ形成のタイムラプス分析については、補足ビデオ 1 を参照してください。 b、カスタム異型アセンブリのエンジニアリング。示された ECD 認識パートナーを持つ synCAM を発現する L929 細胞の 20 倍の共焦点顕微鏡画像の最大投影。 t = 2 時間。アセンブリは、交互（左）、ブリッジ（中央）、および周期的（右）パターンを形成します。孤立した周期的相互作用の画像例を示します。 t = 2 時間。タイムラプス分析は補足ビデオ 2 に示されています。細胞接触分布の確率ボックスを以下に示します。 n = 5。スケールバー、50 μm (左 3 つの画像) および 10 μm (挿入図)。 c、同種親和性結合ロイシンジッパーECDを備えたsynCAM設計（上）。下は、Aph4 または IF1 ロイシンジッパー ECD および ICAM-1 TM/ICD を備えた同種親和性結合 synCAM を発現する L929 細胞の 20 倍共焦点顕微鏡画像の最大投影図 (ULA 丸底ウェル、合計 80 細胞)。スケールバー、50 μm。 t = 24 時間。 3 つの独立した複製の代表的な画像を示します。 d、WT ECADまたは示された同種親和性結合synCAMを発現するL929細胞間のディファレンシャルソーティングの20倍の共焦点顕微鏡画像。スケールバー、20 μm。ｔ＝４８時間。拡張データ図 9 には、代表的な画像が追加の独立複製とともに示されています。n = 15 (ECAD–IF1)、n = 15 (ECAD–Aph4)、n = 14 (IF1–Aph4)、および n = 18 (ECAD–IF1–) Aph4）。 e、WT PCAD（オレンジ）および抗PCAD synCAM（抗PCAD、青）（左）を発現するL929細胞の受容体設計およびディファレンシャルソーティングアッセイの概略図。 anti-PCAD synCAM には ICAM-1 TM/ICD が含まれています。右、WT PCADを発現するL929細胞（オレンジ色）を親（上）またはsynCAM（下）L929細胞（青色）と混合したソーティングアッセイの最大投影画像。スケールバー、50 μm。 t = 0 時間および 24 時間。 4 つの独立した複製の代表的な画像が示されており、追加の複製が拡張データ図 10 に示されています。

ソースデータ

我々は、この一連の直交ヘテロタイプ synCAM が高度に特異的な細胞結合パターンをプログラムできるかどうかをテストしました。 (図 4b および補足ビデオ 2)。我々は以下のパターンでアセンブリを構築しました：（1）2つの細胞（A↔B）で交互に異好性相互作用（細胞AとBにおける異好性GFP-抗GFP synCAMペアの発現）。 (2) 3 つの細胞 (A↔B↔C) の架橋相互作用 (細胞 A および C における直交 synCAM の発現、および架橋細胞 B における両方の相補的 synCAM の発現)。 (3) 3 つの細胞 (A↔B↔C↔A) の周期的相互作用 (細胞 A、B、C のそれぞれにおける 2 つの直交 synCAM の発現)。結果として得られるアセンブリは、synCAM で定義されたセル間の接続に従って編成されます。最近傍分布分析（Harmony画像分析ソフトウェアを使用）は、synCAM指定の相互作用がアセンブリを支配していることを示しました（図4b）。細胞数が少ない拡大画像では、周期的相互作用セットにより、予測される最小の 3 および 4 個のマルチセル集合体が得られる可能性があります (図 4b)。したがって、synCAM の組み合わせにより、セル間の正確な結合接続を指定できます。

次に、自己二量体化コイルドコイルECD相互作用から同型synCAMを操作しました。我々は、それらの逆平行結合トポロジーが細胞内シス結合よりも細胞間トランス細胞相互作用に立体的に有利である可能性があると予想したため、Aph4（コンピューターによって設計されたロイシンジッパー36）およびIF1（ウシATPアーゼ阻害剤IF1）ロイシンジッパーを使用しました36,37。また、コイルドコイルドメインに隣接して介在フィブコンドメイン（フィブロネクチンのコンセンサスFN3ドメイン）を追加して、膜近傍領域からさらに分離することで、細胞間の相互作用をさらに促進できる可能性があります38（図4c）。

我々は、直交同種親和性 synCAM を発現する細胞が分離されたコンパートメントを持つ構造を予測どおりに生成できるかどうかをテストしました。 3つの異なる直交同型CAM（WT ECAD、Aph4 – ICAM-1またはIF1 – ICAM-1）を発現する細胞を組み合わせて混合し（図4d）、得られた集合構造に基づいて分類しました。個々の細胞集団は、同種親和性 synCAM による明確な選別を示しますが、最も印象的なのは、結果として生じる高度にモジュール化された選別動作です。細胞タイプをペアごとに混合すると、IF1 細胞が ECAD または Aph4 に対して中央に分類されることが観察されました。 ECAD 細胞と Aph4 細胞は、2 葉のバーベル構造に分類されます。これらの関係は、3 つのセルタイプすべてが混合された場合にも維持され、コアに IF1 セルを備えた ECAD-Aph4 バーベルセルアセンブリを持つ構造が得られます (アセンブリ統計の拡張データ図 9)。これらの結果は、直交 synCAM のツールキットがモジュール性と予測可能性を備えたマルチコンパートメントの自己組織化構造をどのように構築できるかを示しています。

私たちは、synCAMが、P-カドヘリン（PCAD）などの天然接着分子によって保持されている組織と直接接触できるかどうかをテストしました。したがって、我々は、ICAM-1 ICDに融合された抗PCAD scFvを備えたsynCAMを操作しました（図4e、拡張データ図10および補足ビデオ3）。これらの合成 PCAD 標的細胞は、PCAD によって結合された細胞スフェロイドに効果的に挿入できます。対照的に、synCAMを欠く細胞は除外され、構造の外側に分類されました。したがって、synCAMは、天然の接着分子によって形成される集合体に細胞を組み込むことができます。

私たちは、合成接着分子が初代細胞および人工多能性幹 (iPS) 細胞由来細胞で機能できるかどうかをテストしました。 GFP/抗GFP-ICAM-1 synCAMおよびGFP/抗GFP-テザー分子は、いくつかの初代細胞またはiPS細胞由来細胞で発現されました（拡張データ図11）。 ICAM-1 ベースの synCAM が初代ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト間葉系間質細胞、および iPS 細胞由来平滑筋細胞で発現されると、機能的な同族抗原を発現するパートナー細胞と形成される界面への GFP タグ付き synCAM の強力な局在が観察されました。 -GFP シンカム。この異型細胞間界面への synCAM の再局在化は、非結合細胞（GFP synCAM は界面だけでなく細胞全体に分布したままである）でも、抗 GFP テザーのみを含むパートナー細胞（ICD を含まない）と共培養した場合にも観察されませんでした。）。これらの結果は、synCAM が同族 ECD および機能的に一致する ICD の存在に依存して、これらの異なる細胞型で機能的に相互に関与していることを示しています。

私たちは、合成接着がネイティブ CAM によって組織化された多細胞組織を再構築および再構成できるかどうかを調べました。たとえば、WT ECAD と WT PCAD を発現する L929 細胞は、互いに異なって二葉集合体に分類されます 6。私たちは、GFP-抗GFP synCAM相互作用の導入により、これら2つの分離集団を強制的に統合できるかどうかを調べました（図5a）。異型テザー分子の発現により、二葉集合体は二層（コアシェル）構造に変換され、分離は維持されますが、二葉集合体と比較して異好性接触の数がわずかに増加します。対照的に、より強力な synCAM (ICAM-1 または ECAD ICD) の発現は、二葉構造を、単一の混合コンパートメント内に 2 つの細胞型を含む統合構造に変換しました。これらのsynCAMは、WT PCADまたはWT NCADを発現する、異なって分類されたL929細胞集団の統合を強制することもできます（拡張データ図12a、b）。したがって、synCAM を使用してマルチセルアセンブリを体系的に再構築できます。

a、synCAMを使用して、差次的にソーティングされたL929集団の統合を強制する実験の概略図。 WT ECAD (青) または WT PCAD (オレンジ) を発現する L929 集団から開始します。これにより、二ノーダル構造への分離が生じます。この画像は、（テザー受容体に対して）異なる強度の相互作用を組み込んだ異好性 synCAM の発現によって選別がどのように変化するかを示しています。 ×20 共焦点顕微鏡画像の最大投影が表示されます。スケールバー、20 μm。 t = 24 時間。タイムラプス分析については、補足ビデオ 3 を参照してください。 PCAD/NCAD 分離細胞集団の synCAM 統合の同様の実証が拡張データ図 7 に示されています。b、MDCK 単層 (青) と混合された WT PCAD (オレンジ) を発現する L929 細胞は、MCDK 上皮の上に受動的に位置する回転楕円体を形成します。層。（テザー受容体と比較して）相互作用の強度が増加する GFP-抗 GFP synCAM を追加すると、上皮組織と球状組織の間の機械的結合が増加します。十分に強い場合、2 つの細胞タイプは複雑な格子状ネットワーク (ICAM synCAM) を形成します。画像は、t = 24 時間での組み立てを示しています。 3D 拡大 (上) ビューと最大投影ズームアウト (下) ビューの両方が表示されます。スケールバー、100 μm (上) および 1 mm (下)。結合した組織進化のタイムラプス分析については、補足ビデオ 4 を参照してください。

組織リモデリングをさらに調べるために、我々は、synCAMが、多様な組織や器官の基本的な構成要素である上皮単層を変化させることができるかどうかをテストしました。たとえば、間葉細胞との相互作用による上皮構造の調節は、開発における共通のテーマです。開始上皮細胞層として Madin-Darby 犬腎臓 (MDCK) 細胞を使用しました。 PCADを発現するL929細胞の集団を加えると、それらはコンフルエントなMDCK上皮層の上に位置する分離された同型球状クラスターを形成します。開始上皮（MDCK）組織と回転楕円体（PCAD-L929）組織は最小限の相互作用を示し、独立した集合体として機能します（図5b）。

我々は、架橋合成接着相互作用（対称 ICD を備えた GFP – 抗 GFP ECD を使用）を導入することで、異なる上皮組織と球状組織が強制的に相互作用できるかどうかを検討しました。最小限のテザー相互作用 (ICD なし) を追加すると、PCAD-L929 細胞は MDCK 上皮層にしっかりと座りますが、依然として独立して機能し、分離された回転楕円体構造を維持します。ただし、より強力な ECAD synCAM を導入すると、PCAD-L929 回転楕円体がより平らな星状の隆起に広がり、上皮層とより広範囲に接触します。最後に、さらに強力なICAM-1 synCAMブリッジ相互作用を追加すると、両方の組織の実質的な協力的な再配置が引き起こされます（図5b、拡張データ図12c、および補足ビデオ4）。この場合、L929 セルは MDCK セルの上に連続した格子ネットワークを形成します。さらに、おそらく、L929 細胞と MDCK 細胞の間の強い架橋相互作用が格子の介在空間の表面から MDCK 細胞を引き上げるように見えるため、MDCK 上皮層はコンフルエンスが低下しています。私たちは、この協力的な組織は 2 つの組織の相反する力から生じると仮説を立てています。 L929 細胞間の強力な同型 (PCAD) 誘引と、L929 細胞と MDCK 細胞間の強力な合成架橋相互作用 (synCAM) の組み合わせにより、これら 2 つの集団は機械的にバランスの取れた状態になります。結果として生じるネットワークは、活性化された内皮細胞の自己組織化毛細管ネットワークを彷彿とさせます。簡単に言えば、この格子構成は、L929 細胞が MDCK 上皮層との高度な異型相互作用とともに高度な同型相互作用を同時に維持できる解決策を提供すると考えられます。同様の創発格子ネットワーク構造が、初代細胞における同様の実験で観察された（初代マウス腸上皮層とマウス胎児線維芽細胞；拡張データ図１２ｄ）。要約すると、synCAM は、独立した細胞集団を体系的に結合して、協調的な機構によって複雑な組織構造を生み出す多細胞システムを生み出すことができます。

今回我々は、天然接着分子の設計原理を共有しながら、細胞間の新たな直交結合を特定する多様な合成接着分子を操作する可能性を明らかにする。後生動物は多様な細胞相互作用や組織構築を仲介するために大量のCAMを展開しますが、おそらくさらに多くのインターフェースが進化によって未開発のまま残されています。ここで使用される synCAM 設計戦略は、合成接着を制御するための 2 つのメカニズムを統合します。まず、細胞外相互作用ドメインは細胞間の接続 (結合) を指定します。これは、正確に制御された親和性により同親性または異好性のいずれかになります。第二に、細胞内ドメインは細胞骨格の再構成を決定し、界面の機構と形態を主に決定します。細胞内ドメイン出力のモジュール性と結合した細胞外ドメイン認識の直交性と調整可能性により、生成可能なインターフェイスのセットが拡張されます。したがって、このツールキットはセル間の接続と、その結果得られるインターフェイスのタイプの両方を変更できます。さらに、複数の synCAM とネイティブ CAM を混合して機械的に結合した細胞のシステムを作成すると、複雑な創発構造を持つ組織を生成できます。

広範囲の接着 ICD がキメラ操作に適していることは、細胞内ドメインの機能が内因性の細胞外認識機構からある程度独立していることを示しています。注目すべきことに、ここで使用される単純な細胞外相互作用は、シスオリゴマー化、キャッチ結合、およびアロステリック変化も示す可能性がある多くの天然 ECD の高度な制御とは一致しません 8、39、40、41、42。それにもかかわらず、synCAM は同様のセル間インターフェイスを組み立てるのに依然として十分です。 CAM のモジュール性により、自然の CAM がどれだけ進化したかについての洞察が得られます。たとえば、カドヘリン ECD を持つタンパク質は首鞭毛虫 (後生動物に最も近い単細胞の近縁種) に見られますが、それらには後生動物の ICD がありません 43,44。これらのタンパク質は、細胞間接着のためではなく、食物や基質に結合するために首鞭毛虫によって使用され、その後、細胞内シグナル伝達ドメインとの組換えを通じて細胞間接着のために利用された可能性があります43。

この研究は、CAMを介した細胞間界面の性質を決定する際の細胞内ドメインの主要な役割を裏付けるものである。細胞骨格に関与しない細胞間のテザリング相互作用は、細胞外結合親和性がどのようなものであっても、強力で広範な界面を生成することができません。対照的に、細胞骨格に関与する ICD で構成される synCAM は、界面の各側の ICD のアイデンティティに依存する、より複雑な形態を促進します。これらの観察は、カドヘリン ICD が皮質張力を再構築して細胞界面の拡大と細胞分離に対する抵抗性を駆動することを示唆する以前の研究と一致しています 23,24,45,46,47,48。

最後に、synCAM が、新たに、またはネイティブ CAM によって形成された組織にインターカレートまたはリモデリングすることによって、多細胞構造をプログラミングするための多用途のツールキットを提供することを示します。 synCAM のツールキットは、多様な発達プロセスのメカニズムを分析するために使用できる自己組織化システムの系統的な摂動も可能にします。将来的には、この種の人工接着分子は、組織の修復や再生を正確に指示したり、免疫細胞や神経細胞の相互作用や輸送を制御したりするなど、治療上の問題に対処するために応用できる可能性があります49。

オリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologiesから購入しました。 In-Fusion クローニング試薬、CloneAmp HiFi PCR Premix、Lenti-X コンセントレーターキット、および Stellar ケミカルコンピテントセルはタカラバイオから購入しました。 Miniprep キットとスピンカラムは Qiagen から購入しました。 FuGENE HD Transfection Reagent は Promega から購入しました。 DMEM、GlutaMAX、Alexa Fluor 647 ファロイジン (A22287) および Alexa Fluor 555 ファロイジン (A34055) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。ウシ胎児血清 (FBS) は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校 (UCSF) 細胞培養施設から購入しました。 L929 マウス線維芽細胞 (ATCC、CCL-1) は、American Type Culture Collection から購入しました。 MDCK 細胞は、UCSF のモストフ研究室から寄贈されました。初代真皮線維芽細胞 (CC-2511)、マウス胎児線維芽細胞 (M-FB-481)、およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞 (PT-2501) は、Lonza Bioscience から購入しました。 Nexcelom 3D 384 ウェル超低付着処理丸底マルチウェルプレートは、Nexcelom Bioscience から購入しました。 Cellstar Cell-Repellent Surface 384 ウェル平底プレートは、Greiner Bio-One から購入しました。 384 ウェル光学イメージング平坦透明底 TC 処理プレートは、Corning から購入しました。 H9 ヒト多能性幹細胞 (hPSC) (WA09) は WiCell から購入しました。 EDTA (46-034-CI) および成長因子低減マトリゲル (356231) は、Corning (Corning) から購入しました。 Geltrex、hESC 認定 (A1413302)、Essential 8 Flex Medium Kit (A2858501)、Essential 6 Flex Medium Kit (A1516401) および Advanced DMEM/F12 (12634028) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。組換えヒト/マウス/ラットアクチビン A タンパク質 (338-AC-050) は R&D Systems から購入しました。 iPS 細胞用 FBS (1701) は ScienCell から購入しました。 CellMask 深赤色細胞膜色素は Invitrogen から購入しました。ファロイジン-iFluor 405 試薬 (ab176752) は、Abcam から購入しました。

以下の抗体を購入し、メーカーのプロトコールに従って使用前に PBS で希釈しました。DYKDDDDK エピトープタグ Alexa Fluor 647 結合抗体 (1042E、ウサギ、R&D Systems、IC8529R、AEOB0118081、1:100)。 DYKDDDDK エピトープタグ Alexa Fluor 488 結合抗体 (1042E、ウサギ、R&D Systems、IC8529G、AEOA0521031、1:100); 抗MYCタグ（9B11）マウスモノクローナル抗体（AlexaFluor 647コンジュゲート）（Cell Signaling Technology、2233、25、1:100）。抗 HA タグ (6E2) マウスモノクローナル抗体 (AlexaFluor 647 コンジュゲート) (Cell Signaling Technology、3444、15、1:100)。抗ヒト HGFR/c-MET (95106) AlexaFluor 488 結合抗体 (R&D Systems、FAB3582G、1:50)。抗 EGFR 抗体 (DH8.3) (AlexaFluor 647) (Novusbio、50599AF647、1:50); および抗６×Ｈｉｓタグ（ＨＩＳ．Ｈ８）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１８４、１：１００）。

細胞選別およびフローサイトメトリーは、FACSAria II セルソーターまたは LSR II フローサイトメーター (Beckton-Dickinson) を使用して実行されました。共焦点顕微鏡検査は、384 ウェルプレートで 20 倍の水浸対物レンズを備えた Opera Phenix 自動回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して実行されました。 ×60 および ×100 油浸対物レンズを備えた CSU-X1 スピニングディスク共焦点ユニットを備えた Nikon TiE。または、40 倍の水浸対物レンズを備えた Airyscan 2 を備えた Zeiss LSM 980。

すべての構築物を、SFFV プロモーター、Kozak コンセンサス配列、およびインフルエンザ赤血球凝集素 (MKTIIALSYIFCLVFA)50 の切断可能シグナル配列を含む pHR ベクターにクローニングしました。

synCAM コンストラクトを設計するために、細胞接着分子の膜貫通領域および細胞内領域が UniProt51 のトポロジーアノテーションから特定されました。各 CAM ICD および TM 領域をコードするコドン最適化遺伝子を Integrated DNA Technologies から購入し、In-Fusion クローニングを使用してベクターに挿入しました。各CAM TM および ICD 領域は、In-Fusion クローニングを使用して細胞外結合ドメイン (たとえば、GFP、抗 GFP) に融合されました (補足表 2)。すべてのナノボディまたは scFv ECD の配列は、以前に報告された研究または公開されている特許 20、52、53、54、55、56 から得られました。腸上皮細胞を含む実験では、内部リボソーム侵入部位 (IRES) とピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (Puro) が、pHR ベクター内の GFP-ICAM-1 および GFP-テザー構築物の下流にクローニングされました。プラスミドの配列は RF Biotech によって検証されました。

レンチウイルスは、パッケージングタンパク質（pMD2.Gおよびp8.91）をコードするベクターと目的のpHRプラスミドをFugene 6 HDトランスフェクション試薬（製造元のプロトコールに従って）を使用して、約70℃で6ウェルプレートに播種したHEK293T細胞に同時トランスフェクトすることによって生成しました。 %合流。トランスフェクションの 2 日後、ウイルス上清を収集し、0.45 mm フィルターに通し、直ちに形質導入に使用しました。

初代細胞の形質導入のために、レンチウイルスを、Lenti-X Concentratorキット(Takara)を使用して、製造業者のプロトコールに従って20倍に濃縮した。

L929 細胞と MDCK 細胞は 10% FBS を含む DMEM 中で培養されました。安定した細胞株を作製するために、ウイルス上清 (50 ～ 400 μl) を 1.5 ml の培地で希釈し、12 ウェルディッシュに細胞 (1 × 105 L929 または MDCK) を直接播種しました。次に、感染の 24 時間後、ウイルス培地を通常の増殖培地と交換し、細胞を T25 フラスコ内で増殖させました。細胞は、蛍光タグ付き抗体を使用して適切なエピトープタグについて染色され、蛍光活性化セルソーティング (FACS) によって発現について分類されました。特に断りのない限り、各実験には一括して選別された集団が使用されました。発現レベルが調整された GFP-ICAM-1 および GFP-tether L929 細胞株を生成するために、細胞に添加された総ウイルス量を 50 ～ 400 μl の間で滴定し、FACS を使用して細胞をさまざまな synCAM 発現レベルで分類しました。 Aph4 および IF1 synCAM については、個々の細胞を 96 ウェルプレートに分類することによって単一細胞集団を確立しました。

各細胞株における synCAM の発現レベルを確認するために、FACS を使用して細胞を分析しました。細胞をTrypLEで剥がし、丸底96ウェルプレートに移した。細胞を遠心分離（４００ｇで４分間）によってペレット化し、上清を除去し、蛍光色素結合抗体を含む４０μｌのＰＢＳ中に細胞を再懸濁した。細胞を4℃で50分間染色しました。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁した。次に、フローサイトメトリー (BD LSR II、BD FACSDiva) を使用して細胞を分析しました。次に、フローサイトメトリーデータを FlowJo (TreeStar) を使用して分析しました。

実験を行う前に、TrypLE を使用してすべての細胞株を剥がし、1 ml DMEM に再懸濁し、計数してから 1 ml あたり 4 × 105 細胞に希釈しました。サイトゾル BFP および GFP synCAM を安定的に発現する L929 細胞を、細胞忌避表面を備えた 384 ウェル平底プレート内でサイトゾル mCherry および抗 GFP synCAM を発現する L929 細胞と 1:1 で混合しました（3.2 × 104 細胞、80 μl総量、37 °C)。 t = 3 時間で、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用してプレートを 20 倍の倍率で画像化しました。最大投影画像はメーカーのソフトウェア (Harmony) からエクスポートされました。同様のサイズの異なる細胞ペアが特定され、ImageJ で接触角が測定されました。 ImageJ では、細胞全体に存在するシグナルの一部として細胞間界面に局在する GFP シグナルを測定することにより、GFP 濃縮パーセンテージを決定しました。測定された接触角と濃縮値のデータ分析は、Prism 9 (GraphPad) で実行されました。

我々は、GFP でコーティングされた表面上に広がる synCAM 細胞の速度、界面サイズ、および形態を特徴付けました。精製した GFP タンパク質を PBS で最終濃度 0.5 μM に希釈し、8 ウェルのガラス底イメージングチャンバーの底面をコーティングするのに十分な量 (約 100 μl) を塗布しました。この溶液を氷上で10分間インキュベートした。過剰な溶液を除去し、チャンバーをPBSですすいだ。次に、チャンバーを、10 mg ml-1 ウシ血清アルブミン (BSA) および 1 mg ml-1 ベータカゼイン (Sigma-Aldrich) の溶液で氷上で最低 1 時間ブロックしました。ブロッキング溶液を除去し、チャンバーをＰＢＳで３回洗浄した。 CellVis (C8-1.5HN) チャンバーを使用する場合、抗 6x-His 抗体 (ab18184) および 6x-His タグ付き GFP (ab134853) を使用して、表面を GFP で完全にカバーしました。 PBS中の抗体の100倍希釈物をチャンバーの表面上で4℃で1時間インキュベートした。 PBS で 3 回洗浄した後、His タグ付き GFP を含む 10 μg ml-1 溶液を表面上で 4 °C で 1 時間インキュベートしました。次に、チャンバーを10 mg ml-1 BSAおよび1 mg ml-1 ベータカゼイン（Sigma-Aldrich）の溶液で氷上で最低1時間ブロックしました。ブロッキング溶液を除去し、チャンバーをＰＢＳで３回洗浄した。

拡散アッセイ用の細胞を準備するために、L929 細胞をトリプシン EDTA を使用して剥がし、細胞培養培地に再懸濁しました。コンフルエントな T25 フラスコからの再懸濁細胞溶液約 50 μl を細胞培養培地 200 μl に加え、イメージングチャンバーに配置しました。次に、チャンバーを、Oko Labs 環境制御ステージを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡に移しました。細胞は、2 時間にわたって 3 分ごとに×60 油浸対物レンズで画像化されました。最初の 60 ～ 90 分間、synCAM 細胞の細胞質で発現される細胞質蛍光タンパク質をモニタリングすることで、表面への異なる細胞の拡散が観察されました。

細胞のマスクを取得するために強度を二値化することによって画像を分析し、それを使用してフットプリントの総広がり面積 (A) と周囲長 (p) を計算できます。界面の形態を特徴付けるために、円形度 (c = p2/4πA) が計算され、異なる synCAM 間で比較されました。これらの測定は、抗フラグタグ蛍光抗体 (ラベル synCAM コンストラクト) を使用して、カバースリップとの界面の面積と形態を直接測定することもできました。異なる拡散速度を比較するために、時間の経過に伴う面積の変化を次の形式で当てはめました。 A = bt1/4 ここで、b は拡散速度係数です。このモデルは、接着表面上での細胞の拡散速度を比較するために以前に使用されました 26。解析はMATLAB(2020a)で実装されました。

アクチン細胞骨格を視覚化するために、標準的な手順に従って、拡散細胞を固定し、免疫組織化学のために染色しました。細胞を細胞骨格緩衝液（10 mM PIPES、100 mM NaCl、300 mM スクロース、1 mM EGTA、1 mM MgCl2）中の4% PFA中で氷上で20分間固定しました。次いで、細胞を３回洗浄し、氷上で１０分間、ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ－１００溶液で透過処理し、再度３回洗浄した。次に細胞を 10% BSA を含む PBS (PBS-BSA) で 4 °C で最低 1 時間ブロックしました。アクチン細胞骨格を視覚化するために、細胞を蛍光標識ファロイジン (Alexa 647、555、または 405 蛍光色素のいずれかで結合) で染色しました。次に、倍率 100 倍の対物レンズを使用した回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化しました。細胞周縁部は、CellMask深赤色細胞膜染色剤(Invitrogen)で染色することによって決定した。細胞の拡散に対する細胞骨格阻害剤の影響を調べる測定では、細胞を阻害剤を含む培地に導入し、GFP でコーティングされた表面 (CK666 (100 μM)、ラトランキュリン B (5 μM)、SMIFH2 (100 μM)、ブレビスタチン (50 μM) 阻害剤は Abcam から購入しました)。次に、Zeiss 980 Airyscan 顕微鏡と 40 倍の水浸対物レンズ (Zen Blue) を使用して画像化する前に、上記の手順に従って細胞を固定および染色しました。

実験を行う前に、TrypLE を使用してすべての細胞株を剥がし、1 ml DMEM に再懸濁し、計数してから 1 ml あたり 1 × 103 細胞に希釈しました。サイトゾル BFP およびさまざまな親和性の抗 GFP synCAM を安定的に発現する L929 細胞を、サイトゾル mCherry およびさまざまな親和性の抗 GFP synCAM を発現する L929 細胞、および GFP-ICAM-1 を発現する L929 細胞と異なるウェルで 1:1:1 で混合しました。 384 ウェル ULA 丸底ウェル (総容量 80 μl)。 t = 24 時間で、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用してウェルを 20 倍の倍率で画像化しました。

多細胞ディファレンシャルソーティングアッセイにおいて異なる synCAM 発現細胞の組織を定量化するために、マルチチャネル 3D 共焦点スタックから動径分布関数 g(r) を計算しました。 mCherry および BFP を発現する細胞を、z ステップサイズ 10 μm で 20 倍の倍率で画像化しました。画像スタック内の各スライスは、カラーチャネルごとにしきい値処理および二値化され、クラスターの質量中心 (COM) が見つかりました。 g(r) は、COM からの各ピクセルの距離を計算し、クラスター内のピクセルの密度に正規化することによって求められました。クラスター内のセルの分布をキャプチャする単一の値を作成するために、g(r) 分布の COM を計算し、BFP セルの値から mCherry セルのこの値を差し引きました。したがって、大きな値は mCherry セルがクラスターの中心に近いことを示し、小さな値は BFP セルがクラスターの中心に近いことを示します。画像解析はMATLAB(2020a)で実装しました。

直交異好性ペアとサイトゾル mCherry または BFP を備えた synCAM を安定して発現する L929 細胞が生成されました。実験を行う前に、TrypLE を使用して細胞株を剥がし、1 ml DMEM に再懸濁し、計数してから 1 ml あたり 4 × 105 細胞に希釈しました。各ペアを、細胞忌避表面を備えた 384 ウェル平底プレート内で 1:1 で混合しました (3.2 × 104 細胞、総量 80 μl、37 °C)。 t = 3 時間で、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用してプレートを 20 倍の倍率で画像化しました。最大投影画像は、製造元のソフトウェアを使用して生成されました。

異好性 synCAM ペアの直交性を検証するために、サブセットを親 L929 細胞から区別して選別する能力について特徴付けました。 TrypLE を使用して synCAM 細胞株を剥がし、1 ml DMEM に再懸濁し、計数した後、1 ml あたり 1 × 103 細胞に希釈しました。親 L929 細胞を TrypLE を使用して剥がし、製造元の指示に従って CellTrace Far Red で染色し、1 ml あたり 1 × 103 細胞に希釈しました。 2 つの synCAM と WT L929 細胞を ULA 丸底ウェル内で 1:1:1 (合計 80 μl) で混合し、24 時間後に蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用して倍率 20 倍で画像化しました。次に、製造元のソフトウェア (Harmony) を使用して最大投影画像を生成しました。ソフトウェア内で、個々のセルがセグメント化され、すべてのセルの平均位置に基づいてアセンブリの中心が計算されました。次に、以前に計算されたアセンブリの中心からの WT (Far Red) L929 細胞と synCAM (BFP) 細胞の距離が決定されました。次に、WT セルと synCAM セルの平均距離の差が計算され、ヒートマップとして表されました。距離が大きいほど、アセンブリからの WT セルの除外が増加することに対応します。

同型 synCAM は、結合領域の ECD シス相互作用を立体的に損なうように設計されました。シス結合よりトランス結合に有利なはずの逆平行ロイシンジッパーが、膜近傍領域から受容体を延長するフィブコンリンカードメインに融合されている37、38、36。 fibcon リンカーを使用せずに同型 synCAM を設計する試みは失敗しました。これらの操作された ECD は、ICAM-1 TM/ICD に融合されました。

同種親和性 synCAM 受容体およびサイトゾル mCherry を安定して発現する L929 細胞が生成されました。クローン細胞株は、単一細胞ソーティングを通じて取得されました。 TrypLE を使用して細胞株を剥がし、1 ml DMEM に再懸濁し、計数した後、1 ml あたり 1 × 103 細胞に希釈しました。細胞を 384 ウェル ULA 丸底プレート (細胞 80 個、総量 80 μl、37 °C) で 24 時間インキュベートし、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) で画像化しました。最大投影画像は、製造元のソフトウェア (Harmony) を使用して生成されました。

WT PCAD およびサイトゾル mCherry を発現する L929 細胞は、以前に生成されました6。抗 PCAD synCAM (ICAM-1 TM/ICD) の安定発現ありまたはなしでサイトゾル BFP を発現する L929 細胞を、384 ウェル ULA 丸底プレート内で WT PCAD およびサイトゾル mCherry を安定発現する L929 細胞と 1:1 で混合しました ( 80 細胞、総量 80 μl、37 °C) を 24 時間処理し、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用して画像化しました。最大投影画像は、製造元のソフトウェア (Harmony) を使用して生成されました。 Harmony ソフトウェア内で、WT PCAD (mCherry) を発現する L929 細胞と WT 細胞または抗 PCAD 細胞 (BFP) の両方によって囲まれる総面積を、個別のウェルからの各時点での最大投影画像ごとに計算しました。次に、BFP 対 mCherry 細胞の面積の比率を計算し、24 時間にわたってプロットしました。比率の増加は、多細胞集合体からの BFP 細胞の除外に対応します (拡張データ図 10b)。さらに、t = 24 時間、細胞をセグメント化し、アセンブリの中心の位置を mCherry+ 細胞と BFP+ 細胞の平均位置として計算しました。次に、集合体の中心までのBFP+およびmCherry+細胞の相対距離が計算され(拡張データ図10c)、BFP+ L929細胞の排除の増加に対応する距離が大きくなりました。

多細胞パターニング実験では、TrypLE を使用して L929 細胞株を剥離し、1 ml DMEM に再懸濁し、計数してから 1 ml あたり 1 × 103 細胞に希釈しました。希釈前に、製造元のプロトコールに従って、Aph4 synCAM と IF1 synCAM をそれぞれ CellTrace Far Red と CFSE で染色しました。

2細胞交互パターンを生成するために、GFP-ICAM-1を発現するL929細胞（セル1）を、サイトゾルmCherryおよびLaG16-ICAM-1（抗GFP）を発現するL929細胞（セル2）と混合しました（1：1 80μl）合計）。 3 細胞架橋パターンを生成するために、GFP-ECAD を発現する L929 細胞 (セル 1) を、サイトゾル mCherry、LaG16-ECAD、抗 CD19-ICAM-1 を発現する細胞 (セル 2)、およびサイトゾル BFP および CD19 を発現する細胞と混合しました。 –ICAM-1 (セル 3) (1:2:1 合計 80 µl)。 3 細胞周期パターンを生成するために、GFP-ECAD および抗 MBP-ICAM-1 を発現する L929 細胞 (セル 1) を、LaG16-ECAD および mCherry-ICAM-1 を発現する細胞 (セル 2)、および MBP を発現する細胞と混合しました。 –ICAM-1、LaM4 –ICAM-1 およびサイトゾル BFP (セル 3) (1:1:1 合計 80 µl)。すべての場合において、細胞をULA丸底ウェルに播種し、2時間後に共焦点顕微鏡(Phenix)を使用して画像化した。個別のウェルからの最大投影画像は、製造元のソフトウェア (Harmony) を使用して生成されました。相互作用確率テーブルを計算するために、最大投影画像ごとにセルが調和してセグメント化されました。分割された細胞の位置から細胞間の接触を特定し、それぞれの相互作用の確率を計算してヒートマップとして表現しました。

分離された 3 細胞および 4 細胞の環状アセンブリを形成するには、GFP-ECAD および抗 MBP-ICAM-1 を発現する L929 細胞 (セル 1)。 LaG16 – ECAD および mCherry – ICAM-1 (セル 2)。 MBP-ICAM-1、LaM4-ICAM-1、およびサイトゾル BFP (セル 3) を 1 ml あたり 4 × 103 細胞に希釈し、細胞忌避表面を備えた平底ウェルにプレーティングしました。個々のペアが識別され、最大投影画像が生成されてエクスポートされました。

Wt ECAD およびサイトゾル BFP、Aph4-ICAM-1 または IF1-ICAM-1 を発現する L929 細胞を、ULA 丸底ウェル内で互いに（個別にまたは 3 つすべてを一緒に）混合しました（1:1 または 1:1:1、合計80μl）。 48 時間後に共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化しました。最大投影画像は、製造元のソフトウェア (Harmony) を使用して個別のウェルから生成され、集合表現型に基づいて分類されました。

成人ヒト皮膚線維芽細胞 (NHDF-Ad) およびマウス胎児線維芽細胞 (MEF) を 10% FBS を含む DMEM 中で培養しました。間葉幹細胞 (MSC) を間葉幹細胞増殖培地 (Lonza) で培養しました。

synCAM コンストラクトを発現する安定した細胞を生成するために、ウイルス上清 (×20 濃縮ウイルス 15 μl) を 1.5 ml の培地で希釈し、80% コンフルエンシーまで増殖させた細胞 (12 μl プレートにプレーティングした 5 × 104 MSC、MEF、または NHDF) を直接プレーティングしました。 -まあ皿）。次に、形質導入の 24 時間後、ウイルス培地を通常の増殖培地に交換し、細胞を 6 ウェルディッシュに拡大しました。 MEF は、FACS によって synCAM コンストラクトの発現に関してさらに分類されました。

UCSF ヒト配偶子・胚・幹細胞研究委員会 (GESCR) から FF への正式な承認を得て、この研究では WiCell から購入した WA09 ヒト胚性幹細胞株を使用しました。これらの細胞株とその元のサンプルは完全に匿名化されており、作成者は識別子にアクセスできませんでした。

hPSC (WA09、WiCell) は、Geltrex でコーティングされた 6 ウェルプレート上の E8 培地で維持されました。平滑筋分化を開始する 2 日前に、hPSC を EDTA で解離し、Geltrex でコーティングされた 6 ウェルプレートに再播種しました。 hPSC がコンフルエントに達したら、E8 培地を吸引し、100 ng ml-1 アクチビン A を含む 1 ウェルあたり 1 ml の Essential 6 と交換しました。翌日、培地を吸引し、10 ng ml を含む E6 培地 1 ウェルあたり 2 ml と交換しました。 −1BMP4。 2日後、培地を吸引し、10 ng ml-1BMP4を含むE6培地をウェル当たり2 mlと交換した。 5 ～ 9 日目は、細胞を新鮮な E6 培地 + 2% FBS で 1 日おきに維持しました。 10日目以降、培地をAdvanced DMEM/F12 + 10% FBSと週に3回交換した。

synCAM を安定して発現する SMC を生成するために、SMC を 96 ウェルプレートで 80% コンフルエントになるまで増殖させ、1 μl の 20 倍濃縮ウイルスで形質導入しました。 24時間後、培地を除去し、新しい培地と交換した。

腸上皮は、以前に記載されているように単離および培養されました 57。簡単に言うと、小腸陰窩が生後6〜12週齢の雄のC57BL/6マウスの十二指腸から分離されました。組織を、15 mM EDTAを含む氷冷PBSに30分間置き、その後、複数のフラクションで激しくボルテックスして陰窩を解放した。陰窩を含む上清を 70 μM メッシュで濾過し、次に陰窩をペレット化し、成長因子低減マトリゲルに再懸濁し、ENR 培地 (Advanced DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific、12634-028)) で 3D エンテロイドとして培養しました。 1× N2 (Thermo Fisher Scientific、17502-048)、1× B27 (Thermo Fisher Scientific、17504-044)、10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific、15630080)、1× GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific、35050-061) 、1 mM N-アセチルシステイン (Sigma-Aldrich A9165)、100 U ml-1 ペニシリンおよび 100 mg ml-1 ストレプトマイシン (Corning、30-002)、50 ng ml-1 EGF (Sigma Aldrich、E9644.2MG) を添加、１００ｎｇｍｌ−１Ｎｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ６０５７−ＮＧ／ＣＦ）、および５％Ｒ−スポンジン馴化培地）。培地を3日ごとに交換し、オルガノイドを機械的に解離させ、毎週継代した。

これらの実験では、マウスをカリフォルニア大学サンフランシスコ校 (UCSF) の特定病原体フリー動物施設で飼育しました。すべてのメンテナンスと実験は、施設内動物管理使用委員会および実験動物リソースセンターによって確立されたガイドラインに従って実行されました。すべての実験手順は、UCSF の実験動物リソースセンターによって承認されました。マウスは、UCSF パルナッソスの UCSF LARC 動物管理施設で飼育されました。彼らは、特定の病原体のない個別のスイートに収容されました。マウスは、人工呼吸器ケージ内でケージあたり最大 5 匹のマウスを飼育し、12 ～ 12 時間の明暗サイクルと制御された温度と湿度条件 (20 ～ 26 °C、30 ～ 70%) で餌と水を自由に摂取させました。

synCAM コンストラクトの発現のために、オルガノイドに以前に記載されているようにレンチウイルスを形質導入しました 58。まず、TrypLe を使用して 3D エンテロイドを単一細胞に解離し、その後、成長因子を減少させた Matrigel および形質導入培地 (50% Wnt3a 馴化培地、10 μM ニコチンアミドを補充した NR 培地 (Sigma-Aldrich、N3376-100G)) で増殖させました。、5 μM CHIR (Sigma-Aldrich、SML1046-5MG) および 10 μM Y-27632 (Sigma-Aldrich、Y0503-1MG)) を 3 ～ 5 日間添加して幹細胞を濃縮します。次に、エンテロイドを解離、ペレット化し、8 μg ml-1 ポリブレン (Sigma-Aldrich、H9268-5G) と濃縮レンチウイルスを含む形質導入培地に再懸濁し、600 g で 1 時間、32 °C で遠心分離し、37 °C で 6 時間インキュベートしました。 h. 次いで、細胞をペレット化し、マトリゲルに再懸濁し、形質導入培地中で３日間増殖させ、その後、ＥＮＲ培地に切り替えた。増幅後、1 μg ml-1 ピューロマイシン (Thermo Fisher Scientific、A1113803) を培地に添加することによって抗生物質の選択を実行しました。

GFP-ICAM-1、GFP-テザー、抗 GFP-フィブコン-ICAM-1、または抗 GFP-フィブコン-テザーを MSC、NHDF、または SMC に形質導入しました。これらの実験では、初代細胞での発現を向上させるために、抗 GFP-ICAM-1 構築物と抗 GFP-テザー構築物の両方にフィブコンリンカードメインが含まれています。すべての GFP 発現細胞にはサイトゾル BFP 発現用のプラスミドを同時形質導入し、すべての抗 GFP 発現細胞にはサイトゾル mCherry を発現する構築物を同時形質導入しました。次に、形質導入の 24 時間後に培地を除去し、新しい培地と交換しました。 4 ～ 7 日後、MSC、SMC、または NHDF を TryplE で剥がし、培地に再懸濁し、384 ウェルプレートに播きました。次に、プレーティングの 24 時間後に、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用してウェルを画像化しました。

WT PCAD、サイトゾル mCherry および LaG16 – synCAM (ICAM-1、ECAD またはテザーコントロール) を安定的に発現する L929 細胞を、WT ECAD、サイトゾル BFP および GFP – synCAM (ICAM-1、ECAD またはテザーコントロール) を安定的に発現する L929 細胞と 1:1 で混合しました。テザーコントロール）をULA丸底プレートに入れます（合計80細胞、80μl、24時間、37℃）。混合する前に、TrypLE を使用して L929 細胞株を剥がし、1 ml DMEM に再懸濁し、計数してから 1 ml あたり 1 × 103 細胞に希釈しました。蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix、倍率 20 倍) を使用してアセンブリを画像化し、製造元のソフトウェアを使用して個別のウェルからの最大投影画像を生成して示します。

WT NCADを発現するL929細胞とWT PCADを発現するL929細胞との間の集合を改変するために、WT ECAD細胞の代わりにWT NCADおよびサイトゾルGFPを発現するL929細胞を用いて、上記と全く同様に実験を実施した。

サイトゾルBFPおよびGFP-テザー、GFP-ICAM-1またはGFP-ECADを発現するMDCK細胞の接着層が、384ウェルプレートのウェル内に形成されました（ウェルあたり16,000細胞が播種）。 48時間後、WT PCAD、サイトゾルmCherry、およびLaG16-ICAM-1、LaG16-テザー、LaG16-ECADを発現するL929細胞、または追加の受容体を加えなかったL929細胞を添加しました（ウェルあたり24,000細胞）。 2 つの層間の相互作用は、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用して 24 時間画像化されました。アセンブリのズームアウト画像は、製造元のソフトウェアから画像をエクスポートした後、9 つの隣接する視野をつなぎ合わせて形成されました。 mCherry+ アセンブリの真円度と表面積の両方は、メーカーのソフトウェア (Harmony) 内で実験の各フィールドについて定量化されました。

単層エンテロイド培養は、以前に記載されているように確立されました59。 TrypLE を使用して 3D Enteroid を単一細胞に解離し、PBS で洗浄し、CellTrace を使用して染色しました。 GFP-ICAM-1 または GFP-Tether を発現する合計 150,000 個の細胞を、3 μM CHIR および 10 μM Y-27632 を添加した 40 μl ENR 培地中の 5% 増殖因子低減マトリゲルでプレコートした 384 ウェルプレートにプレーティングしました。。 4時間後、さらに60μlのENR培地を各ウェルに加えた。次に、プレーティングの 24 時間後、エンテロイド単層、抗 GFP-フィブコン-テザーまたは抗 GFP-フィブコン-ICAM-1 を発現するマウス胎児線維芽細胞 (MEF)、およびサイトゾル mCherry を追加しました (16,000 細胞)。 24 時間後、蛍光共焦点顕微鏡 (Phenix) を使用してウェルを画像化しました。最大投影画像と 3D 画像はメーカーのソフトウェア (Harmony) からエクスポートされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結論を裏付ける実験データは、記事と補足情報で入手できます。この研究で使用されたすべてのデータベースは公開されています。タンパク質配列とドメイン構造を特定するために、Universal Protein Resource (https://www.uniprot.org/) を使用しました。 CAM ICD 内の線状モチーフの同定には、真核生物線状モチーフ (ELM) リソース (http://elm.eu.org/) を使用しました。追加の顕微鏡複製は Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21647546.v1) で入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

ディスカッション、支援、アドバイスをいただいた D. Mullins、Z. Gartner、V. Weaver、M. Kutys、および Lim 研究室および Cell Design Institute のメンバーに感謝します。この研究は、NSF セルラー構築助成金センター (DBI-1548297)、NIH NCI (U01CA265697)、および UCSF Cell Design Institute によって支援されました。 AJS は Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG、2355-19) の支援を受ける Damon Runyon フェローであり、Hartz Cell Design フェローでもあります。 ARH は、NSERC Discovery Grant (RGPIN-2022-04933) によってサポートされました。 JG は、UCSF 助成金番号 2R25NS070680-11 を通じて国立神経障害・脳卒中研究所から支援を受けました。

アンドリュー・R・ハリス

現在の住所: カナダ、オンタリオ州オタワ、カールトン大学機械航空宇宙工学部

ウェスリー・L・マッキーサン

現在の住所: Maze Therapeutics、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

UCSF セルデザイン研究所、カリフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

アダム・J・スティーブンス、ジョサイア・ガーツ、キ・H・キム、ウェスリー・L・マッキーサン、ウェンデル・A・リム

カリフォルニア大学細胞分子薬理学教室、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州

アダム・J・スティーブンス、ジョサイア・ガーツ、キ・H・キム、ジョナサン・T・ラミレス、ウェスリー・L・マッキーサン、ファラナク・ファタヒ、ウェンデル・A・リム

細胞構築センター、カリフォルニア大学サンフランシスコ、米国カリフォルニア州

アダム・J・スティーブンス、アンドリュー・R・ハリス、ジョサイア・ガーツ、キ・H・キム、ウェスリー・L・マッキーサン、ダニエル・A・フレッチャー、ウェンデル・A・リム

カリフォルニア大学バイオエンジニアリング学部、バークレー、カリフォルニア州、米国

アンドリュー・R・ハリス＆ダニエル・A・フレッチャー

カリフォルニア大学ワイル神経科学研究所神経内科、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジョサイア・ゲルツ

カリフォルニア大学、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州頭蓋顔面生物学プログラム

コラリー・トレンテソー & オフィール・D・クライン

カリフォルニア大学、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州口腔顔面科学科

コラリー・トレンテソー & オフィール・D・クライン

イーライおよびエディスブロードセンターオブ再生医学および幹細胞研究、カリフォルニア大学サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジョナサン・T・ラミレス & ファラナク・ファタヒ

米国カリフォルニア州ロサンゼルス、シダーズ・サイナイ医療センター小児科

オフィル・D・クライン

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ダニエル・A・フレッチャー

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AJS、ARH、CT、FF、ODK、DAF、および WAL が研究を設計しました。 AJS、JG、KHK、および WLM はプラスミドをクローン化し、細胞株を生成しました。 AJSは細胞間接着実験を実施しました。 ARH は細胞拡散接着実験を実施しました。 AJSCT、JTR、KHKは初代細胞とiPS細胞由来細胞の接着実験を実施した。 AJS と ARH がデータを分析しました。 AJS、ARH、DAF、WAL が論文を執筆しました。

ウェンデル A. リムへの通信。

WAL は Allogene および SciFi Foods のアドバイザーであり、Gilead および Intellia の株式を所有しています。この研究で報告されている人工接着分子に関して、カリフォルニア大学サンフランシスコ校が特許出願しており、WALとAJSが発明者として挙げられている(PCT/US2021/057601)。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Matthias Lutolf と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) 細胞選別後の L929 線維芽細胞における GFP (左) および αGFP (右) synCAM 発現の FACS 分析。各 synCAM の表面発現は、標識された抗 FLAG タグ抗体を使用して測定されます。各コンストラクトの CAM TM および ICD ドメインが示されています (テザー = ICD を欠くコントロール、DLL1 = デルタ様タンパク質 1、JAM-B = 結合接着分子 B、NCAM-1 = 神経細胞接着分子 1、MUC-4 = ムチン) 4、ICAM-1 = 細胞間接着分子 1、Ecad = E-カドヘリン、Intβ1 = ベータ 1 インテグリン、Intβ2 = ベータ 2 インテグリン)。分析により、テザーと代替の synCAM コンストラクトの表面発現レベルがよく一致していることが示されています。 (b) synCAM 細胞間接着界面解析の追加複製。ペアワイズ synCAM インターフェースの 20 倍共焦点顕微鏡画像の最大投影 (t = 3 時間): GFP 発現細胞 (青) は、αGFP 発現細胞 (オレンジ) に結合しています。界面の GFP チャネルが示されており、受容体の濃縮の違いが強調されています。追加の 20 例のうち 4 つをここに示します。（c）細胞ソーティング後のサイトゾルmCherry（左）またはBFP（右）を発現するL929線維芽細胞におけるαGFP synCAM発現のFACS分析。各コンストラクトの CAM TM および ICD ドメインは ICAM-1 であり、各コンストラクトの GFP 結合ラマナノボディ (LaG) ECD が示されています。この分析は、この一連の代替アフィニティー synCAM が同等のレベルで発現されていることを示しています。（ d ）ペアワイズsynCAMインターフェースの20倍共焦点顕微鏡画像の最大投影（t = 3時間）：GFP発現細胞（青）は、示された結合Kd（オレンジ）でαGFP発現細胞に結合します。

(a) 細胞選別後のサイトゾル mCherry を発現する L929 線維芽細胞における αGFP synCAM 発現の FACS 分析。各コンストラクトの CAM TM および ICD ドメインは NCAM-1 または Intβ1 であり、各コンストラクトの GFP 結合ラマナノボディ (LaG) ECD が示されています。この分析は、この一連の代替アフィニティー synCAM が同等のレベルで発現されていることを示しています。 (b) ペアワイズ synCAM インターフェイスの 20 倍の共焦点顕微鏡画像の最大投影 (t = 3 時間、スケールバー = 10 μm)。上: GFP 発現細胞 (青) は、αGFP 発現細胞 (オレンジ) に結合しています。各ペアの CAM TM および ICD ドメインは Intβ1 です。下: 界面での受容体の濃縮の違いを強調する上記界面の GFP チャネル。 (c) ペアワイズ synCAM インターフェイスの 20 倍の共焦点顕微鏡画像の最大投影 (t = 3 時間、スケールバー = 10 μm)。上: GFP 発現細胞 (青) は、αGFP 発現細胞 (オレンジ) に結合しています。各ペアの CAM TM および ICD ドメインは NCAM-1 です。下: 界面での受容体の濃縮の違いを強調する上記界面の GFP チャネル。（ d ）対応する LaG ナノボディ親和性と関連して、b および c に示す界面から測定された接触角のプロット（データは、n = 10 ペアの平均値、誤差 = 95 % CI として表示されます）。 Intβ1（青）の接触角は、NCAM-1（赤）および図1fのテザーコントロール（黒）との関係で示されています。（ e ）対応するLaGナノボディ親和性と関連して、bおよびcに示される界面から測定されたGFP濃縮のプロット（データは、n = 10ペアの平均値、誤差 = 95％CIとして表示されます）。 NCAM-1 (赤) の GFP 濃縮を、Intβ1 (青) および図 1f のテザーコントロール (黒) と比較して示します。

ソースデータ

(a) ディファレンシャルソーティング競合アッセイの漫画描写 (左) とヒートマップとして表される放射状分布の定量化 (右)。この実験は、図1fに示す接触角測定とは異なる、多様なsynCAM駆動の細胞間相互作用の接着選好性/強度を測定する代替方法を表しています。ここでは、表面 GFP L929 細胞 (ベイト細胞) を、それぞれが異なる αGFP synCAM を持つ 2 つの競合する差別的に標識された L929 細胞と混合します。 synCAM のより強力な接着は、ベイト細胞と組み合わせたコアへの競合細胞の共選別の相対的な度合いによって評価されます。回転楕円体の重心から競合する細胞 (赤/青) の放射状分布を計算します。（ b ）GFP-ICAM-1を発現するL929細胞と混合した、示されたECD LaGナノボディ（mCherryまたはBFP）を含むαGFP-ICAM-1を発現するL929細胞間のセルソーティング競合アッセイの代表的な最大投影画像（t = 24時間、スケールバー） = 50 μm)。 (c) b からのセルソーティング競合アッセイの定量化 (n = 4)。（ d ）αGFP-ICAM-1を発現するL929細胞とサイトゾルを発現するL929細胞と、GFP-ICAM-1を発現するL929細胞と混合したαGFP-Tetherを発現するL929細胞との間のセルソーティング競合アッセイの代表的な最大投影画像（スケールバー= 20μm、t = 24） h)。 (e) d からの細胞選別競合アッセイの定量化 (n = 4)。

ソースデータ

(a) ICAM-1 または Tether ICD による細胞選別後の L929 線維芽細胞における GFP synCAM および αGFP synCAM 発現の FACS 分析。 GFP コンストラクトについては、細胞 (Y 軸) と αFlag APC 647 抗体で染色した細胞 (X 軸) の両方における総 GFP シグナルの発現が示されています。 (b) パネル a の異なる発現レベルのペアワイズ synCAM インターフェースの 20 倍共焦点顕微鏡画像 (t = 3 時間、スケールバー = 10 μm) の最大投影: GFP 発現細胞 (青) は、αGFP 発現細胞 (オレンジ) に結合します。）。各ペアの CAM TM および ICD ドメインは ICAM-1 または Tether です。 (c) bに示す界面から測定した接触角の箱ひげ図(箱= 25〜75パーセンタイル、ひげ=最小〜最大、中心=中央値)(n = 10ペア)。

ソースデータ

（a）図2の細胞拡散アッセイの顕微鏡画像の例。すべてのsynCAM種の表現型を示しています（スケールバー = 10μm）。 Tether n = 10、ICAM-1 n = 20、JAM-B n = 20、MUC-4 n = 15、NCAM-1 n = 20、Intβ1 n = 20、Intβ2 n = 20 からの独立した複製の代表的な画像を示します。 SynCAM は L929 線維芽細胞で発現され、GFP でコーティングされたガラス表面にプレーティングされます。膜色素によって検出された細胞フットプリントは青色の輪郭で示されます。ファロイジンで染色したアクチンを白色で示します。 (b) 細胞拡散アッセイを描いた漫画。 αGFP synCAMを発現するL929細胞をGFPでコーティングされた表面に播種し、経時的にモニタリングします。 (c) 示された synCAM を発現する L929 細胞の細胞拡散アッセイからの画像。共焦点画像からの個々のスライスが表示されます。スケールバー = 10 μm。（ d ）示された synCAM を発現する L929 細胞の代表的な細胞拡散接触領域進行曲線。エラー = SEM。（ e ）示されたsynCAMを発現するL929細胞の計算された拡散定数（nは分析された固有の細胞の数、Tether n = 24、Ecad n = 17、JAM-B n = 23、ICAM-1 n = 16、Intβ1 n） = 16、Intβ2 n = 18、NCAM-1 n = 14、MUC-4 n = 12。示された線は中央値を表します)。

ソースデータ

（ a ）GFPコーティング表面上に広がり、ファロイジンで染色されたαGFP JAM-B、ICAM-1、またはテザーを発現するL929線維芽細胞の顕微鏡画像の例（スケールバー= 10μm）。示されたアクチン調節阻害剤の存在下で拡散が示されます。少なくとも 10 の関心領域が 2 つの別々の日に画像化されました。 (b) 最大投影共焦点画像 (スケールバー = 10 μm)、および ERM 結合ドメイン (BD) に変異を持つ ICAM-1 ICD を含む synCAM 界面の計算された接触角 (ボックス = 25 から 75 パーセンタイル、ひげ = 最小から 75 パーセンタイル)最大、中心 = 中央値、n = 20 ペア)60. （ c ）最大投影共焦点画像（スケールバー = 10μm）、および2つの「NPxY」タリン結合ドメインモチーフに変異を持つIntβ1 ICDを含むsynCAMインターフェースの計算された接触角（ボックス = 25〜75パーセンタイル、ひげ = 最小〜75パーセンタイル）最大、中心 = 中央値、n = 20 ペア)61. （ d ）最大投影共焦点画像（スケールバー = 10 μm）、および 2 つの「NPxF」タリン結合ドメインモチーフに変異を持つ Intβ2 ICD を含む synCAM インターフェースの計算された接触角（ボックス = 25 から 75 パーセンタイル、ひげ = 最小から 75 パーセンタイル）最大、中心 = 中央値、n = 20 ペア)62. （e）最大投影共焦点画像（スケールバー= 10μm）、およびβ-カテニン結合ドメインに変異があるEcad ICDを含むsynCAMインターフェースの計算された接触角（ボックス= 25～75パーセンタイル、ひげ=最小～最大、中央） = 中央値、n = 20 ペア)63. （ f ）最大投影共焦点画像（スケールバー = 10μm）、および Ser および Tyr リン酸化部位に変異を持つ MUC-4 ICD を含む synCAM インターフェースの計算された接触角と GFP 濃縮（ボックス = 25 ～ 75 パーセンタイル、ひげ = 最小）最大まで、中心 = 中央値、n = 20 ペア)。（ g ）最大投影共焦点画像（スケールバー = 10μm）、PDZ結合ドメインに変異を持つJAM ICDを含むsynCAMインターフェースの計算された接触角とGFP濃縮（ボックス = 25〜75パーセンタイル、ひげ = 最小〜最大、中心 = 中央値、n = 20 ペア)。（ h ）最大投影共焦点画像（スケールバー = 10 μm）、および Cys パルミトイル化部位に変異を持つ NCAM-1 ICD を含む synCAM インターフェースの計算された接触角と GFP 濃縮（ボックス = 25 ～ 75 パーセンタイル、ひげ = 分～最大、中心 = 中央値、n = 20 ペア)64.

ソースデータ

（ a ）ペアワイズsynCAMインターフェースの20倍の共焦点顕微鏡画像の最大投影（スケールバー= 10μm、t = 3時間）：GFP発現細胞（青）は、示されたCAM ICDを含むαGFP発現細胞（オレンジ）に結合しています。 10 個の独立した細胞ペアの代表的な画像が示されています。 (b) aに示す細胞ペアのGFPチャネル。

(a) synCAM ECD ペアの直交性を決定するために使用されるディファレンシャルソーティングアッセイを示す漫画。 SynCAM ペアを親 L929 細胞と混合し、24 時間後に画像化します。親細胞のソートは、同族の synCAM ECD が正しく一致し、結合できる場合にのみ行われます。 (b) 直交 ECD を備えた synCAM のサブセットの差分ソーティングアッセイの代表的な最大投影画像 (スケールバー = 20 μm)。親 L929 細胞の選別は、一致する ECD の場合にのみ観察されました。 (c) b からのソートの定量化 (n = 6)。親 L929 細胞と BFP+ 細胞の間の球の中心からの平均距離の差が計算され、ヒートマップとして表示されます。親細胞の排除は、synCAM ペアが一致する場合に観察されます。 (d) 単一 ECD 内に複数のエピトープを含む synCAM 設計の代表的な最大投影画像 (スケールバー = 20 μm)。 HA-CD19 ECD は、αCD19 または αHA synCAM のいずれかに対してのみ異なるソーティングを示します。したがって、複数の接着パートナーとペアリングできる OR ゲート synCAM を生成できます。 (e) d からのソートの定量化 (n = 6)。親 L929 細胞と BFP+ 細胞の間の球の中心からの平均距離の差が計算され、ヒートマップとして表示されます。親細胞の排除は、synCAM ペアが一致する場合に観察されます。

ソースデータ

WT Ecad または示された同種親和性結合 synCAM を発現する L929 細胞間の差分選別の 20 倍共焦点顕微鏡画像の最大投影 (スケールバー = 50 μm、t = 48 時間)。 Ecad-IF1 (a)、Ecad-Aph4 (b)、IF1-Aph4 (c)、および Ecad-IF1-Aph4 (d) の代表的な画像、アセンブリ分類、分布を示します。

（a）WT Pcad（オレンジ）を発現するL929細胞が親（左）またはsynCAM（右）L929細胞と混合されるソーティングアッセイの最大投影画像（青、t = 0、24時間、スケールバー = 50μm）。（ b ）24時間のアセンブリ中のBFPネガティブコントロールまたはαPcad synCAMとmCherry（Pcad）L929細胞の間の相対面積の定量化（n = 4の生物学的に独立したサンプル、誤差 = SEM）。面積の差が大きいことは、Pcad 球がよりコンパクトであること、および BFP+ 細胞が除外されていることと一致します。（ c ）組み立て後の球の中心からの細胞（BFP-mCherry）あたりの相対距離の定量化（t = 24時間、n = 4の生物学的に独立したサンプル、線=平均）。 WT BFP 細胞は、より大きな距離の差を示しますが、これは Pcad 球からの排除と一致していますが、αPCAD synCAM は挿入されます。

ソースデータ

MSCで発現したαGFPおよびGFP synCAM（ICAM-1 ICDあり）または対応するテザー（ICDなし）の20倍の共焦点顕微鏡画像の最大投影（a、スケールバー = 10 μm）、初代真皮線維芽細胞（b、スケールバー = 20 μm）または iPSC 由来の SMC (c、スケールバー = 20 μm)。 αGFP 細胞も mCherry で標識されました。 GFP 細胞も BFP で標識しました。 3 つの独立した複製の代表的な画像を示します。どちらの細胞タイプでも、GFP テザーは細胞全体に拡散して広がります。対照的に、GFP-synCAM はアテテロ型の細胞間界面が非常に豊富です (白い矢印)。 GFP-synCAMを発現する細胞をパートナー細胞なしで播種すると、GFPは細胞全体に拡散して分布します。

(a) synCAM の導入による WT Ncad (緑色) と WT Pcad (オレンジ) のソーティングの調節を描いた漫画。（ b ）示された異好性synCAMの発現を伴うWT PcadおよびWT Ncad L929細胞の20倍共焦点顕微鏡画像の最大投影（スケールバー= 20μm、t = 24時間）。 GFP-synCAMはNcad発現L929細胞で発現され、αGFP synCAMはPcad発現L929細胞で発現されます。 3 つの独立した複製の代表的な画像を示します。このデータは、synCAMが、PcadとEcadセルの間で可能であるのと同様に、差次的にソーティングされたPcadとNcadセルの間の統合を促進できることを示しています（図5a）。（c）図5bの20倍共焦点画像の最大投影からのL929細胞の真円度（左）と総表面積（右）の定量化（データは、2つの独立したウェルにわたって分析されたn = 18の固有フィールドの平均値として表示されます。誤差） = SD)。（d）GFP-αGFPテザー（左）または合成ICAMのいずれかを使用した、マウス腸上皮単層（緑色）とマウス胎児線維芽細胞（MEF）（オレンジ）間の多細胞集合体の3D（上）および最大投影（下）ビュー-1 (右) 異種親和性接着相互作用。 2 つの独立した複製の代表的な画像が示されています。

ソースデータ

SynCAM セル間インターフェイス。接触角と GFP 濃縮の測定が提供されます。誤差 = 95% CI。

この研究で使用されたタンパク質構築物の配列。エピトープタグは赤色で強調表示され、ECD結合領域は青色で、TM領域とICDは太字で表示されます。

synCAM で使用される CAM ICD の SLiM ドメイン。 SLiM は、ELM データベースと文献ソースから特定されました。

直交 synCAM ペアによるセルの自己集合。 ICAM-1 ICD を備えた代替 ECD を示します (図 4a にリンク)。

3 セルの synCAM インタラクションネットワーク。 3 細胞 synCAM 相互作用ネットワークが細胞集合を駆動します (図 4b にリンク)。

ネイティブアセンブリへの SynCAM インターカレーション。 Anti-PCAD synCAM（ICAM-1 ICD）は、PCADクラスターへの細胞インターカレーションを駆動します（図4eにリンク）。

組織組織の再構築。 SynCAMは、上皮組織と球状組織の結合と複雑なリモデリングを促進することができます（図5bにリンク）。

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転載と許可

Stevens、AJ、Harris、AR、Gerdts、J. 他合成細胞接着分子による多細胞集合のプログラミング。 Nature 614、144–152 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

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受信日: 2021 年 10 月 28 日

受理日: 2022 年 12 月 2 日

公開日: 2022 年 12 月 12 日

発行日: 2023 年 2 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

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