ヒト DUT 遺伝子の 2 つの新しいアイソフォームを発見

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7760 (2023) この記事を引用

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ヒト細胞では、2 つの dUTPase アイソフォームが報告されています。1 つは核 (DUT-N)、もう 1 つはミトコンドリア (DUT-M) であり、同族局在シグナルを持ちます。 対照的に、ここでは 2 つの追加のアイソフォームを特定しました。 DUT-3 には局在信号がありません。DUT-4 には DUT-N と同じ核局在信号があります。 アイソフォーム特異的同時定量のための RT-qPCR 法に基づいて、起源が大きく異なる 20 のヒト細胞株における相対的な発現パターンを分析しました。 DUT-N アイソフォームが最も高いレベルで発現され、次に DUT-M および DUT-3 アイソフォームが続くことがわかりました。 DUT-M と DUT-3 の発現レベル間の強い相関関係は、これら 2 つのアイソフォームが同じプロモーターを共有している可能性があることを示唆しています。 未処理細胞と比較して、dUTPase アイソフォームの発現に対する血清飢餓の影響を分析したところ、A-549 細胞と MDA-MB-231 細胞では DUT-N の mRNA レベルが減少しましたが、HeLa 細胞では減少しなかったことがわかりました。 驚くべきことに、血清飢餓により、DUT-M および DUT-3 は発現の大幅な増加を示しましたが、DUT-4 アイソフォームの発現レベルは変化を示さなかったのです。 我々の結果を総合すると、細胞の dUTPase 供給は細胞質でも提供されている可能性があり、飢餓ストレスによって誘導される発現変化は細胞株に依存することが示されます。

ポリメラーゼは、メチル基が 1 つだけ異なる dUTP と dTTP を区別できないため、適切な dUTP/dTTP 比を維持することが最も重要です1。 酵素 dUTPase は、dUTP の dUMP とピロリン酸への加水分解を触媒し、dNTP プールから dUTP を除去することにより、ゲノムの完全性を維持する役割を担っています 2,3。 dUTP が利用可能な場合、取り込まれたウラシルは、塩基除去修復機構の一部としてウラシル DNA グリコシラーゼによって切断されます 4。 dUTP レベルの上昇は、DNA 修復プロセスの過剰活性化によってチミンのない細胞死を引き起こす可能性があり 5、これを防ぐには、dUTPase 酵素の活性が必要です。 dUTPase によって触媒される反応のもう 1 つの役割は、de novo dTTP 合成経路におけるチミジル酸シンターゼの基質である dUMP を生成することです。

現在までに、ヒト dUTPase の 2 つのアイソフォームが文献に記載されており、それぞれ核とミトコンドリアに局在しており、おそらくこれら 2 つの DNA 含有細胞小器官における dUTP プール制御を確実にするためと考えられます。 2 つのアイソフォームは DUT 遺伝子によってコードされ、選択的スプライシングと組み合わせた選択的プロモーターの使用によって生成されます 7,8。 ミトコンドリアアイソフォーム (DUT-M) にはミトコンドリアターゲティング配列が含まれているのに対し、核アイソフォーム (DUT-N) には核局在化シグナルが含まれているため、2 つのアイソフォームは最初のエクソンのみが異なります 7、9、10。 dUTPase の 2 つのアイソフォームは、Ladner et al. によって説明されました。 それぞれ mRNA レベルとタンパク質レベルでのノーザンブロット分析とウェスタンブロット分析を使用します7。 34Lu ヒト肺線維芽細胞におけるアイソフォームの RNA 発現レベルも、細胞が細胞周期から抜け出して休止状態に入る血清飢餓下で調査されました。 Ladner らによると、この移行により DUT-N dUTPase アイソフォームの発現が大幅に減少しますが、DUT-M アイソフォームのレベルは変化しません。

最近のハイスループットシーケンス研究では、DUT-3 (UniProt ID: A0A0C4DGL3、NCBI RefSeq ID: NM_001025249.1) および DUT-4 (UniProt ID: H0YNW5、NCBI RefSeq ID: NM_001330286.2）を今作で。 配列データベースによると、3 番目に提案されたアイソフォーム (DUT-3) には局在化シグナルが含まれていないため、細胞質ゾルに保持されている可能性が最も高いことが示唆されました。 DUT-3 の 5' UTR 領域の上流部分は DUT-M のそれと同一ですが、DUT-M アイソフォームの最初のエクソンに存在するミトコンドリア リーダー配列は DUT-3 アイソフォームには存在しません。 4 番目に示唆されたアイソフォーム (DUT-4) は、N 末端のいくつかのアミノ酸が異なるだけで、DUT-N アイソフォームによく似ていると予測されました。 このアイソフォームの最初のエクソンはゲノム内で他のアイソフォームの上流に位置するため、その発現は、このアイソフォームの制御を変更する可能性がある代替プロモーターによって駆動される可能性があります。 これら 2 つの新規ヒト dUTPase アイソフォームの生理学的発現レベルまたは役割に関するデータはまだ報告されていません。

ここでは、新しいアイソフォームの生理学的役割についての洞察を得るために、さまざまながん細胞株および正常なヒト細胞株におけるヒト dUTPase の 4 つのアイソフォームの遺伝子発現データを紹介します。 RT-qPCR は、2 つの新規アイソフォームを同定し、さまざまな細胞株で 4 つすべてのアイソフォームの mRNA 発現を個別に定量するために選択した方法です。 RT-qPCR の利点には、優れた特異性、広い線形ダイナミック レンジ、優れた感度と再現性が含まれます 11、12、13、14、15。 遺伝子発現解析のための信頼できる RT-qPCR 法を開発するには、徹底的な最適化と適切な参照遺伝子の使用が必要です 16、17、18。 以前の記事で、我々はこの研究で使用したのと同じヒト正常細胞株とがん細胞株で新規参照遺伝子を同定しました19。 さらに、同じアプローチを使用し、同じ最適化ステップを実行して、dUTPase アイソフォームの遺伝子発現を分析するための RT-qPCR 法を開発しました。

私たちの目的は、dUTPase アイソフォームの mRNA 発現レベルを特異的に測定することでした。 まず、Ensemble、UniProt、および NCBI Reference Sequences (RefSeq) データベースを調査し、Consensus CDS (CCDS) プロジェクトも考慮しました。 Ensemble データベースには、8 つのタンパク質コーディング アイソフォームと 3 つの非タンパク質コーディング アイソフォームが存在し、そのうち 9 つは UniProt 識別子 (P33316 [DUT-M]、P33316-2 [DUT-N]、A0A0C4DGL3 [DUT-3]、H0YNW5) を持ちます。 [DUT-4]、H0YNJ9、H0YKC5、H0YMP1、H0YMM5、H0YKI0)。 オンラインツールClustal Omegaを使用し、デフォルト設定を使用して複数のタンパク質配列アライメントを実行しました。 補足図 1 は、位置合わせの結果を示しています。 酵素 dUTPase には、真核生物、原核生物、DNA ウイルス、レトロウイルスの間で 5 つの保存されたモチーフがあります 2。 UniProt データベースに記載されている 9 つのアイソフォームのうち、すべての保存モチーフを含むのは 4 つだけです。これには、よく知られている DUT-N および DUT-M のアイソフォームと、本記事では DUT-3 および DUT-4 と呼ばれる 2 つの新規アイソフォームが含まれます。 。 さらに、NCBI RefSeq データベースにはこれら 4 つのアイソフォームのみが存在します (NM_001025248.2 [DUT-M]、NM_001948.4 [DUT-N]、NM_001025249.1 [DUT-3]、および NM_001330286.2 [DUT-4])。 CCDS 識別子 (CCDS32231 [DUT-M]、CCDS45255 [DUT-N]、CCDS45256 [DUT-3]、および CCDS81879 [DUT-4]) を持ちます。 CCDS データベースには、一貫して注釈が付けられた高品質の配列が含まれています。 さらに、PeptideAtlas データベースでヒト dUTPase アイソフォームを調査しました 20。 標準的な DUT-N および DUT-M アイソフォームのほかに、ペプチド カバレッジが 100% である唯一のタンパク質は DUT-3 と DUT-4 です。 他の仮説上のアイソフォームのペプチドカバレッジは不完全であり、これらのタンパク質の細胞内存在には疑問があります。 要約すると、機能的な 4 つのアイソフォーム (DUT-M、DUT-N、DUT-3、および DUT-4) のみを調査することを目的としました。

図 1A は、DUT 遺伝子のゲノム配列のプロモーター領域を示しています。 すべての dUTPase アイソフォームは代替プロモーターの使用と代替スプライシングによって生成されますが、すべてのアイソフォームは mRNA レベルで同じ 3' 末端を共有し、タンパク質レベルで対応する C 末端を共有します。 4 つの dUTPase アイソフォームの遺伝子発現レベルを決定することに加えて、共通の配列に位置するプライマー ペアを設計することにより、すべてのアイソフォームの発現をまとめて (DUT-all) 決定することも目的としました。 アイソフォーム特異的決定に使用されるプライマー設計の詳細な説明は、「材料と方法」に記載されています。 表 1 には、この研究で使用したプライマーの主要なパラメーターが含まれています。 図 1B に示します。

部分ゲノム配列 (A) および dUTPase アイソフォームのタンパク質配列 (B)。 パネル (A): DUT-4 アイソフォームの最初のエクソンはオレンジ色で示され、DUT-3 アイソフォームの最初のエクソンは水色で示されています。 DUT-M アイソフォームの最初のエクソンには、DUT-3 アイソフォーム (水色) の最初のエクソンが含まれており、DUT-M アイソフォームに固有の濃い青色の配列セグメントも含まれています。 DUT-N アイソフォームの最初のエクソンは、赤と緑の配列セグメントで示されています。赤の配列は DUT-N アイソフォームに固有であり、緑の配列はすべてのアイソフォームに共通です。 RT-qPCR で使用されるプライマー配列には下線が付けられています。 DUT-3 アイソフォーム用に設計されたイントロンにまたがるフォワード プライマーは、灰色の背景で示されています。 一般的なリバース プライマーは黄色の背景で示されています。 翻訳開始部位 (ATG) は、対応するアイソフォーム (DUT-M、濃い青色、DUT-N、赤色、DUT-3、明るい青色、DUT-4、オレンジ色) として色付けされた斜体の影付きテキストで示されています。 (B) dUTPase アイソフォームのタンパク質配列。 最初のエクソンに対応するペプチドセグメントはゲノム配列に従って色付けされ、他のエクソン配列は黒で表示されます。 濃い緑色の配列は、DUT-3 を除くすべてのアイソフォームに共通です。 薄緑色の配列はすべてのアイソフォームに共通です。 コア核局在シグナル (KRAR) に下線が引かれています。 図は Microsoft Office 2013 で作成しました。

前回の記事では、RT-qPCR19 で測定された相対的な遺伝子発現の正規化に適切な参照遺伝子を特定しました。 現在の研究では、以前に調製したものと同じ RNA サンプルを使用します。 20 のヒト癌および正常細胞株から 3 つの生物学的複製 RNA サンプルを調製しました。 間もなく、正常細胞株と癌細胞株が培養され、3 つの生物学的複製から採取されました。 抽出後、RNA サンプルの完全性をアガロースゲル電気泳動で調査しました。 アガロースゲル画像上には、18S および 28S リボソーム RNA サブユニットに対応する 2 つの異なるバンドが見えました。これは、分解やゲノム DNA の汚染がないこと、つまり、調製された RNA サンプルが全体的に良好な品質であることを示しています。 RNA サンプルの濃度と純度を決定するために、NanoDrop 測定を実行しました。 260/280 比は 2.02 ～ 2.11 の範囲にあり、タンパク質の汚染がないことが示されました。 260/280 および 260/230 の吸光度比および RNA 収量とゲル電気泳動の結果は、前回の記事で補足資料としてまとめられています 19。

逆転写 (RT) 反応のパフォーマンスは、逆転写酵素、プライミング戦略、および反応中の RNA の量に大きく依存します 21、22、23。 qPCR で信頼性の高い遺伝子発現結果を得るには、RT 反応の線形ダイナミック レンジ内で作業することが基本です。 対象となるターゲットや参照遺伝子も含めて、各ターゲット RNA の調査が重要です。 この研究で使用した参照遺伝子については、以下で説明するのと同じ最適化プロセスが実行され、その結果は以前の記事で公開されました19。 市販の 2 つの逆転写キット、Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR と High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit を比較しました。 RNA サンプルから一連の 6 ポイント 4 倍希釈液を調製した後、各キットを使用して逆転写反応を実行しました。 反応中の全 RNA の量は 50 ～ 1600 ng の範囲でした。 最高濃度および最低濃度のポイントは線形ダイナミック レンジから外れましたが、参照遺伝子を含むすべてのターゲットについて RNA 100 ～ 800 ng の範囲で直線性が確認されました (図 2)。 100 ～ 800 ng RNA の範囲内で技術的反復の平均に対して最小二乗線形回帰を実行しました。 RT-qPCR 用 Maxima First Strand cDNA 合成キットでは、Cq 値が低くなり、参照遺伝子を含むすべてのターゲットの逆転写効率が向上したことが示されました。 DUT-M アイソフォームの場合、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit を使用すると、直線フィット ラインの傾きが明らかに平坦になりましたが、RT-qPCR 用 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit を使用すると、直線フィット ラインの傾きがより平坦になりました。十分でした。 前のキットを使用すると、DUT-M アイソフォームの測定感度が明らかに低下します。 したがって、さらなる実験のために、RT-qPCR 用の Maxima First Strand cDNA 合成キットが選択され、200 ng のトータル RNA が使用されました。

逆転写反応の最適化。 RNA 希釈系列の qPCR 測定から得られた Cq 値を、RT-qPCR 用 Maxima First Strand cDNA 合成キット (黒線) と高容量 cDNA 逆転写キット (灰色の線) と比較して示します。 各濃度ポイントで、両方のキットの 3 つの技術的複製が白丸として描かれています。 最小二乗線形回帰は、反応あたり 100 ～ 800 ng の RNA 量の範囲での技術的反復の平均に対して実行されました。 (A) DUT-M、(B) DUT-N、(C) DUT-3、(D) DUT-4、および (E) DUT-all の個々のグラフは、OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) で作成されました。図は CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) を使用して組み立てられました。

標的遺伝子の発現を正確に定量するには、各標的の qPCR 効率を決定することが重要であり、さらに、正確で堅牢な qPCR 法は効率が高いことが特徴です 24。 PCR 産物からの希釈系列を調製し、3 つの技術的複製を使用した次の qPCR 反応のテンプレートとして使用しました。 このアプローチを使用すると、幅広い濃度範囲を調査できますが、効率を決定するために cDNA テンプレートの段階希釈を使用すると、マトリックス効果が考慮されます 25。 したがって、効率は、DUT-N アイソフォーム (97.7%) および DUT-all ターゲット (100%) の cDNA テンプレートでも測定されました。 2 つのアプローチを比較すると、効率値に大きな違いは見つかりませんでした。PCR 製品をテンプレートとして使用した DUT-N アイソフォームでは 97%、DUT-all ターゲットでは 96.1% でした。 結果として得られた Cq 値は、適用された希釈に対してプロットされ、技術的反復の平均に対して最小二乗線形回帰が実行されました (補足図 S2)。 効率値は、近似された直線の急峻さから計算されました26。 効率値と回帰係数値を表 1 にまとめます。

4 つのアイソフォームに関する PCR 産物の特異性を検証するために、PCR 産物をサンガー配列決定に送りましたが、すべての PCR 産物の長さが 90 塩基対未満であるため、ネステッド PCR デザインが適用されました 27。 別のリバース プライマーと適切なフォワード プライマーを使用して各ターゲットに対してより長い PCR 産物を生成し、これらの産物を精製してサンガー シーケンスで分析しました。 より長い PCR 産物の配列は、公開データベース内の対応する配列と同一でした。 これらの長い PCR 産物には、それぞれのシングルラウンド PCR 産物の配列が含まれています。 次に、配列決定された産物を希釈し、ヒト cDNA テンプレートに加えて、表 1 にリストされているプラ​​イマーを使用して、PCR の 2 回目のラウンドのテンプレートとして使用しました。 ネステッドおよびシングルラウンド PCR 反応からの 2 つの PCR 産物の同一性は、融解曲線分析とアガロースゲル電気泳動の結果を比較することによって評価されました。 融解曲線は同一であり(補足図S3)、バンドはアガロースゲル上の同じ位置に現れた(補足図S4)ため、すべてのPCR産物は意図した標的に特異的であると結論付けました。

私たちの以前の研究では、本研究で使用したのと同じヒト正常細胞株および癌細胞株で 12 個の候補参照遺伝子を調査しました 19。 我々は、The Human Protein Atlas28 の RNA HPA 細胞株遺伝子データに基づいて、新規の候補参照遺伝子として SNW1 および CNOT4 を同定しました。 広く使用されている参照遺伝子 (ACTB、GAPDH、IPO8、PPIA、PUM1、RPL30、TBP、UBC) に加えて、Jo et al.29 が示唆しているように、HNRNPL と PCBP1 も研究に含めました。 結果を評価するために、GeNorm、NormFinder、BestKeeper、比較 ΔCt 法などのいくつかのアプローチが適用されました。 信頼性の高い正規化を行うには、実験の偏りを最小限に抑えるために、少なくとも 2 つの参照遺伝子の使用が推奨されます 16、30、31。 我々の結果に基づいて、我々は安定した参照遺伝子として IPO8、PUM1、HNRNPL、SNW1、CNOT4 を使用することを提案しました 19。したがって、この遺伝子セットを dUTPase アイソフォームの遺伝子発現解析の参照として使用しました。 血清飢餓の影響を評価するために、CNOT4、PUM1、および PCBP1 を参照遺伝子として使用しました。dUTPase アイソフォームのタンパク質配列は、ゲノム配列に従って色分けされています。

ヒトがん細胞株と正常細胞株のセットから 3 つの生物学的複製 RNA サンプルを調製した後、dUTPase アイソフォームの発現と DUT-all ターゲットを調査しました。 この目的のために、逆転写反応で使用される総 RNA 量と qPCR 反応で増幅される cDNA の量は一定に保たれました。 IPO8、PUM1、HNRNPL、SNW1、CNOT4を参照遺伝子として適用して遺伝子発現値を計算するためにΔΔCq法を使用しました。 dUTPaseアイソフォームおよびDUT-allターゲットの最高および最低の相対正規化発現を有する細胞株の増幅曲線を補足図S5に示します。 Cq 値に基づくと、調査したすべての細胞株において DUT-N アイソフォームの dUTPase アイソフォームの発現が最も高く、次に DUT-M アイソフォーム、DUT-3 アイソフォームが続きます。 DUT-4 アイソフォームは dUTPase アイソフォームの発現が最も低いですが、調査した細胞株の一部では DUT-3 および DUT-4 アイソフォームが同程度に発現しています。

調査した20の細胞株の各dUTPaseアイソフォームおよびDUT-allターゲットの相対正規化発現値を図3Aに示します。 相対的な正規化された発現値と標準偏差を補足表 S1 にまとめます。 DUT-M および DUT-3 アイソフォームの相対正規化発現は、U-937、RPMI-8226、および U-251MG 細胞株で最も高く、MDA-MB-231 細胞株で最も低いことが判明しました。 DUT-N、DUT-4、および DUT-all ターゲットの場合、相対的な正規化発現は、HL-60(TB)、U-937、MOLT-4、RPMI-8226、および U-251MG 細胞でかなり高かった。線。 ヒト多能性幹細胞株 HUES-9 と人工多能性幹細胞株 XCL-1 を比較すると、各アイソフォームと DUT-all ターゲットの相対正規化発現は、p 値が 0.4 以上であったため、有意な差はありません。すべての場合において。 DUT-4 アイソフォームの発現レベルは細胞株間で最も大きな差を示し、最高発現レベル (U-937) と最低発現レベル (HCT-116) の間には 50 倍の差がありました。

dUTPase ターゲットの相対的に正規化された遺伝子発現データと Cq 値の相関分析。 (A) 各パネルで、最も発現が低い細胞株の発現値を 1 に設定しました。y 軸のスケールは 10 を底とする対数であり、各パネルで 1 から 100 まで均一に表示されます。 エラーバーは、各細胞株の 3 つの生物学的複製 (n = 3) の標準偏差を示します。 個々の色は、表 2 で使用されている色に対応しています。個々のグラフは、CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) で作成されました。 (B) DUT-N と DUT-all ターゲット、および (C) DUT-M と DUT-3 ターゲットの Cq 値の相関分析。 比較しやすいように、軸に表示される範囲は両方のグラフで一定です。 回帰係数値は、すべてのデータ点に対する最小二乗線形回帰を使用して決定されました。 個々のグラフは OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) で作成され、図は CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) を使用して組み立てられました。

さまざまなアイソフォームの相対的な発現レベルの間で潜在的な共通の制御要素を明らかにするために、dUTPaseアイソフォームの2つのターゲットとDUT-allターゲットのすべての組み合わせのCq値の相関関係を分析しました（補足図S6）。 DUT-N アイソフォームと DUT-all ターゲットの Cq 値の間に相関関係があり (図 3B)、さらに DUT-M と DUT-3 アイソフォームの間にも相関関係が見られました (図 3C)。 両方の相関関係は、すべてのデータ ポイントに対する最小二乗線形回帰で決定された 0.85 より高い回帰係数値で特徴付けられました。 対照的に、他のすべての組み合わせは回帰係数値が 0.62 未満であり、相関関係がないことを示しています。 相関分析により、3 つの重要な観察結果が得られました。 まず、増幅曲線に基づくと、DUT-N は dUTPase アイソフォームの発現が最も高いため、このアイソフォームが dUTPase の全体的な発現を支配します。これは、DUT-N と DUT-all の発現パターン間の強い相関関係に反映されています。 第二に、DUT-M と DUT-3 アイソフォームの両方が同じプロモーターから転写されることを考慮すると、これら 2 つのターゲット間の相関関係が予想され、この発見は DUT-M と DUT-3 に共通のプロモーターがあるという示唆をさらに強化します。 第三に、DUT-4 アイソフォームを含むあらゆる組み合わせに相関がないことは、DUT-4 の独立した異なる発現制御を提供する代替プロモーターの存在を主張します。

発現される異なるアイソフォームの比率は細胞が適切に機能するために重要である可能性があるため、正常および癌細胞株における全体的な発現と比較して、発現される dUTPase アイソフォームのパターンを調査しました。 MDA-MB-231 細胞株の 1 つの生物学的複製サンプルの相対正規化発現を 1 に設定しました。各アイソフォームの相対正規化発現値を DUT-all の相対正規化発現値と、その比の底 2 の対数で割りました。正規分布が得られるように計算されました。 異なるアイソフォームの発現レベルの関係を説明するために、「比率指標」と呼ばれるこれらの値を使用して、数値は考慮すべきではなく、観察された差異のみが重要であることを強調しました。 異なる細胞株で測定された 3 つの生物学的複製サンプルの分散は等しくないため、XLSTAT を使用してボンフェローニ補正を使用したノンパラメトリックのクラスカル・ワリス分析とそれに続くコノバー・イマンのペアワイズ比較を実行しました。 各アイソフォームについて、正常細胞株の比率指標を癌細胞株のグループと比較しました。 図 4 に結果を示します。

さまざまなアイソフォーム (A) DUT-M、(B) DUT-N、(C) DUT-3、(D) DUT-4 の相対正規化発現レベルと、DUT-all ターゲットで測定された全体の dUTPase 発現との関係。 すべての癌細胞株は、各正常細胞株と対で比較するために使用されるグループに含まれました。 がん細胞株は赤色で表示されます。 正常細胞株の個々の色は、表 2 で使用されている色に対応しています。y 軸は、各アイソフォームの相対的な正規化された発現値と対数スケールでの全体の発現値の比率である比率指標を示します。 各グループの平均は黒い線で示されます。 p 値は、ペアごとの比較の結果を示します。 差異は p < 0.0018 で有意であることが判明し、アスタリスク (*) で示されています。 個々のグラフは OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) で作成され、図は CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) を使用して組み立てられました。

DUT-N および DUT-4 アイソフォームの場合、有意な差は見つかりませんでした。 DUT-N の発現が最も高いため、このアイソフォームと全体の発現との関係は細胞株間でほぼ等しいと予想されました。 DUT-4 アイソフォームの発現は最も低くなりますが、その比率指標も大きな変化を示さず、正常な細胞株の中で非常に安定しています。 ただし、DUT-M および DUT-3 アイソフォームの場合、正常な細胞株間で差異が観察されました。 HEK293、HUES-9、および XCL-1 細胞株は、癌細胞株グループと有意な差異は見出されませんでした。 ヒト多能性幹細胞株 HUES-9 と人工多能性幹細胞株 XCL-1 は、これらの細胞株の類似性を示す、比率指標値の上昇ではなく同様の値を示しました。 HEK293 は Ad5 で形質転換された部分的に分化した前駆細胞株であり、これが正常な細胞群からの分岐の理由である可能性があります。 対照的に、分化した正常細胞株 HMEC、HUVEC/TERT2、MRC-5、および HFF-1 は有意な増加値を示しました。 DUT-M および DUT-3 アイソフォームの比率指標値は、それらの共通のプロモーターをさらに主張する平行した変化を示しました。

血清飢餓は、さまざまな細胞プロセス、代謝経路、薬物治療の効果に関与する分子機構を明らかにするためにヒト細胞株を調査するいくつかの研究分野で一般的に使用される治療法です32。 以前に、血清飢餓時の DUT-N および DUT-M の相対的な mRNA 発現が、Ladner らによって 34Lu 正常ヒト肺線維芽細胞において調査されました。 ノーザンブロット技術を使用する7。 この研究の結果は、DUT-M の mRNA 発現は構成的であるが、DUT-N の mRNA 発現は血清飢餓により大幅に減少することを示しました。 興味深いのは、dUTPase の新規 2 つのアイソフォーム、DUT-N および DUT-M、さらにさまざまな細胞株での血清飢餓処理下での DUT-all ターゲットの発現を調査して、その効果が細胞に影響を与えるかどうかを判断することです。回線依存。 13 個のヒトがん細胞株のセットを考慮すると、血清飢餓によって細胞の増殖が影響を受けないか、細胞生存率が大きく損なわれるため、ほとんどの細胞株では細胞周期停止を効率的に達成することができません。 したがって、我々は、この治療法が適用できる 3 つのヒトがん細胞株、HeLa、A-549、および MDA-MB-231 を選択しました 33。 血清飢餓は、MDA-MB-231 細胞株の場合は 2 日間、HeLa および A-549 細胞株の場合は 4 日間、3 つの生物学的複製培養物に適用されました。 処理した細胞培養物と未処理の細胞培養物の細胞周期相の分布をフローサイトメトリーで分析しました。 血清飢餓時の G2 および S 期の細胞の比率の減少と並行して、G1 期の細胞の比率の上昇が観察されました (補足図 S7)。 血清飢餓細胞における G1 期の細胞の割合はいずれの場合も 70% 以上であり、細胞周期停止に成功しました。

dUTPase アイソフォームおよび DUT-all ターゲットの遺伝子発現は、血清飢餓細胞と未処理細胞を比較する RT-qPCR 分析によって決定されました (図 5)。 正規化のために、3 つの参照遺伝子 (CNOT4、PUM1、および PCBP1) が、参照遺伝子を調査した以前の記事 19 に基づいて選択されました。 DUT-4 アイソフォームの相対的に正規化された発現は、調査した 3 つの細胞株すべてにおいて血清飢餓中に一定のままでした。 同じプロモーターから転写される DUT-M および DUT-3 アイソフォームの場合、相対的な正規化された発現はいずれの場合も大幅に増加しました。 観察された増幅曲線に基づくと、DUT-N アイソフォームは dUTPase アイソフォームの発現が最も高くなります。 血清飢餓時、DUT-N アイソフォームの相対的に正規化された発現は HeLa 細胞では一定のままでしたが、A-549 細胞と MDA-MB-231 細胞では大幅に減少しました。 DUT-all ターゲットの相対正規化発現は、DUT-N アイソフォームと同じ方向に変化しましたが、変化の程度は小さいことが判明しました。 この現象は、DUT-M および DUT-3 アイソフォームの発現が血清飢餓時に増加し、これにより DUT-N アイソフォームの発現の減少が補われるという事実によるものと考えられます。 血清枯渇サンプルおよび未処理サンプルの相対発現値とエラーバー、および p 値を補足表 S2 にまとめます。

dUTPase アイソフォームの相対正規化発現 (A) DUT-M、(B) DUT-N、(C) DUT-3、(D) DUT-4、および (E) HeLa の DUT-all ターゲット (赤)、A血清飢餓時の -549 (オレンジ) および MDA-MB-231 (黄色) 細胞株、および (F) U-937 細胞株における dUTPase タンパク質のウェスタンブロット分析。 (AE) NT、未処理 (プレーンカラム)。 SS、血清欠乏（縞模様のカラム）。 個々の色は、表 2 で使用されている色に対応しています。y 軸のスケールは 10 を底とする対数であり、各パネルで 1 から 10 まで均一に表示されます。 各パネルで、発現が最も低い生物学的グループを 1 に設定しました。エラーバーは、各細胞株の 3 つの生物学的複製 (n = 3) の標準偏差を示します。 アスタリスクの数は、血清飢餓により遺伝子発現が変化する可能性が高まることを示します。 * p < 0.1、** p < 0.01、*** p < 0.001 (CFX Maestro ソフトウェアによって計算)。 (F) ウェスタンブロットを使用して dUTPase タンパク質を検出するための 3 つの技術的複製サンプル。 左側には、ターゲット dUTPase タンパク質と参照としてのアクチンタンパク質が矢印で示されています。 右側には、対応する理論分子量値が示されています。 個々のフルサイズの画像は補足図 S8 として利用できます。 (A) DUT-M、(B) DUT-N、(C) DUT-3、(D) DUT-4、および (E) DUT-all の個々のグラフは、CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) で作成されました。 (F) 画像は Image Lab 4.1 ソフトウェア (Bio-Rad) で作成されました。 この図は、CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) を使用して組み立てられました。

dUTPase アイソフォームの発現レベルに対する血清飢餓の影響の分析から得られた主要な発見は、飢餓誘発性の摂動が細胞株特異的な様式で発生するということです。 重要なことに、補足図S7に示すように、すべての細胞株で、飢餓による細胞周期停止が同様の程度で観察されました。 したがって、dUTPase アイソフォームの発現レベルで観察されたさまざまな摂動は、細胞周期停止の違いによるものではありません。 最も顕著な結果は、他の細胞株とは対照的に、HeLa 細胞株が血清飢餓に対して強い回復力を示し、DUT-N アイソフォームを高い発現レベルに維持していることです (図 5)。 文献に記載されている主な概念は、dUTPase には二重の役割があるというものです。dNTP プールの消毒のために dUTP を除去することと、新規チミジル酸合成のために dUMP を生成することの両方が不可欠です。 これと一致して、最も豊富なアイソフォーム DUT-N は、ヌクレオチド前駆体生合成や DNA 複製経路の他のメンバーと同様に、細胞周期の S 期に主に増殖依存的に発現されます 7,35,36。 37. 細胞周期停止中は増殖が停止するため、細胞は複製に dNTP を必要としません。 ただし、修復合成は依然として発生する可能性があります。 血清飢餓時に観察された DUT-N アイソフォーム発現の減少は、酵素の役割と一致しています。 しかし、我々の現在のデータは、このスキームは典型的なものかもしれないが、一部のがん細胞株では、継続的な増殖中にがん細胞がシグナル伝達分子に対する感受性を失うため、dUTPase 発現の厳密な制御が失われる可能性があることも示しています。 HeLa 細胞株の場合、増殖は停止しますが、DUT-N アイソフォームの高い発現レベルは維持されます。

DUT-M アイソフォームは、34Lu 細胞において mRNA レベルとタンパク質レベルの両方で構成的に発現されることが以前に示されています 7。 対照的に、調査した 3 つの細胞株では、血清飢餓時に DUT-M アイソフォームの発現が大幅に増加することがわかりました。 この効果は、ミトコンドリアのチミジル酸生合成と、血清飢餓時のミトコンドリア DNA の完全性のより良い保存にとって重要である可能性があります。 我々は、DUT-NおよびDUT-Mアイソフォームの発現は全く異なる機構によって調節されており、細胞株にも依存すると結論付けています。 また、DUT-3 アイソフォームの発現レベルが、調査したすべての細胞株で DUT-M 発現レベルと平行して変化することもわかり、共通のプロモーターが存在することがさらに実証されました。 DUT-4 アイソフォーム (DUT-N と同じ NLS を含む) の発現レベルに有意な変化がないことは、この点で我々が調査した 3 つの細胞株すべてがおそらく飢餓下でも dUTPase の核局在を維持していることを示しています。

dUTPaseアイソフォームのmRNA発現を測定することに加えて、16％アクリルアミドゲルを使用したウェスタンブロット分析（図5F）を使用してアイソフォームのタンパク質発現も調査しました。 1 秒の露光時間の元の画像、40 秒の露光時間の画像、およびタンパク質ラダーと結合された画像は、補足図 S8 として利用できます。 この研究で調査した他の細胞株と比較して、DUT-N および DUT-4 アイソフォームの発現が最も高く、同時に DUT-M および DUT-3 アイソフォームの発現も高い細胞株 U-937 を使用しました。 アクチンを参考として使用しました。 分子量の大きい順に、DUT-M、DUT-N、および DUT-3 アイソフォームに対応する 3 つの異なるバンドを実証しました。 Protein Molecular Mass ツール (https://www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html) を使用して dUTPase アイソフォームの理論的分子量を計算しました。さらに、検出された 3 つのアイソフォームの実験値も計算しました。タンパク質ラダーのバンド。 DUT-N アイソフォームは、ブロット上の巨大なバンドとして見られるように、最も高い mRNA 発現と最も高いタンパク質発現を示します。 DUT-4 アイソフォームの理論的分子量 (17.83 kDa) は、DUT-N アイソフォームの理論的分子量 (17.75 kDa) とほぼ等しいため、DUT-4 アイソフォームはウェスタンブロット技術では検出できません。 DUT-M アイソフォーム (それぞれ 19.35 kDa と 19.38 kDa) および DUT-N アイソフォーム (それぞれ 17.75 kDa と 17.68 kDa) の理論的分子量と経験的分子量は、かなり近いものです。 3 番目に検出されたバンドの実験的分子量 (15.41 kDa) は、DUT-3 アイソフォームの理論的分子量 (15.4 kDa) と本質的に同じであり、この新規アイソフォームの同一性が確認されます。

dUTPase は、植物から酵母、動物に至るまで、これまでに研究されたすべての真核生物に存在する遍在酵素です 34。 この酵素の本質性は、ノックアウト モデルの使用によって示されていますが、ノックダウン モデルは DNA 損傷因子に対する栄養要求性または感受性を示しています 4,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44、 45、46、47。 dUTPase の不可欠な性質とは対照的に、dUTPase のアイソフォーム分布は少数のモデル生物でのみ調査されました。 マウスでは、ヒトと同様に、dUTPase の 1 つの核アイソフォームと 1 つのミトコンドリア アイソフォームが記載されています 6、7、27。 キイロショウジョウバエでは、核および細胞質に 1 つの dUTPase アイソフォームが存在することが示されています 48,49。 Saccharomyces cerevisiae では、二機能性 dITP/dUTP ジホスファターゼが 1 つだけ存在することが示されていますが、その局在は研究されていません 50。 Dictyostelium discoideum では、ミトコンドリアにのみ局在する dUTPase のアイソフォームが 1 つだけ同定されました 51。 この研究において、我々は、起源の異なる多種多様なヒト細胞株において、酵素 dUTPase のさらに 2 つのアイソフォームを mRNA レベルで同定しました (図 6)。 重要なのは、これらの新規アイソフォームの 1 つ (DUT-3) に、オルガネラ局在シグナルが欠如していることをタンパク質レベルで同定したことです。 私たちのデータは、細胞質における dUTPase の存在がショウジョウバエにおける単なる例外的なケースではなく、より一般的な現象である可能性を示唆しています。 実際、dNTP は核孔を通って自由に拡散できるため、dUTPase 酵素が核である必要は明示的かつ直接的には必要ありません。 しかし、この殺菌酵素が核内に存在すると、DNA 合成中の dUTP 除去がより効率的に制御される可能性があり、dUTPase は他の核タンパク質と相互作用する可能性もあります 52。

この研究の主な側面を示す概略図。 濃い青色は DUT-M アイソフォームを示し、赤色は DUT-N アイソフォームを示し、新規アイソフォーム DUT-3 と DUT-4 はそれぞれ水色とオレンジ色で表示されます。 右上隅には代表的な増幅曲線が示されています。 アイソフォーム名のフォント サイズは、その相対的な発現レベルに対応します。 dUTPase アイソフォームの仮説上の細胞局在を破線で示します。 この図は CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) を使用して作成されました。

我々の現在の研究を考慮すると、ヒト細胞のdUTPaseレパートリーはこれまで考えられていたよりも拡張されており、我々の結果によれば、それには3つの異なるプロモーターの制御下にある4つのアイソフォームが含まれています。 さらに多様な dUTPase アイソフォームが他の種でも同定できるかどうかはまだ解明されていません。 1 つのプロモーターは飢餓ストレスに敏感に反応し、核および総 dUTPase mRNA レベルを最大 5 分の 1 に低下させます。 しかし、HeLa 細胞株ではこの強力な制御が失われ、静止状態 (修復合成など) でも DNA ウラシレーションをより適切に制御できる可能性があります。 3 つのプロモーターの中で、DUT-4 核 dUTPase アイソフォームの合成を駆動するプロモーターは最も構成的な特性を示し、dUTPase の核内存在の重要性を強化します。

私たちの目的は、文献の多数の研究で広く使用されている人気のある細胞株を使用することでした。 以前に、13 種類の癌細胞株と 7 種類の正常なヒト細胞株 19 の選択に使用された側面を要約しましたが、この研究でもまったく同じ細胞株が使用されました。 がん細胞株には、HeLa、MCF-7、A-549、K-562、HL-60(TB)、HT-29、MDA-MB-231、HCT 116、U-937、SH-SY5Y、U-251MGが含まれます。 、MOLT-4およびRPMI-8226が含まれますが、正常細胞株にはHEK293、MRC-5、HUVEC/TERT2、HMEC、HFF-1、HUES-9およびXCL-1が含まれます。

細胞株 HEK293 (CRL-1573)、HeLa (CCL-2)、SH-SY5Y (CRL2266)、U-937 (CRL-1593.2)、およびヒト包皮線維芽細胞株 HFF-1 (SCRC-1041) は ATCC から購入しました。 。 細胞株 A-549、HCT 116、HL-60(TB)、HT-29、K-562、MCF-7、MDA-MB-231、MOLT-4、MRC-5、および RPMI-8226 は、国立がん研究所の開発治療プログラム (国立衛生研究所)。 TERT で不死化した HMEC 細胞は、フランシス クリック研究所細胞サービス部門から購入しました。 HUVEC/TERT2 と MRC-5 は、József Tóvári からの寛大な贈り物でした。 ヒト多能性幹細胞株 HUES-9 は、Douglas Melton (HHMI) のご厚意により提供されました。 CD34 + 臍帯血細胞からエピソーマルベクターによって再プログラムされた人工多能性幹細胞株 XCL-1 は、XCellScience (Novato、CAXIP-001-1 V) から入手しました。 A-549、HCT 116、HEK293、HeLa、HL-60(TB)、HT-29、K-562、MCF-7、MDA-MB-231、MOLT-4、RPMI-8226、SH-SY5Y、U- 251MG および U-937 細胞は、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) (Gibco、10500064) および 1% ペニシリン ストレプトマイシン (Gibco) を添加した Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培地 (Gibco、72400-021) で培養しました。 、15140-122）。 ＨＦＦ－１細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で完成されたＤＭＥＭ－グルタマックス培地中のゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされたプレート上で維持された。 HMEC 細胞は、MEGM 乳房上皮細胞増殖培地 BulletKit (Lonza、CC-3150) で培養されました。 HUVEC/TERT2 細胞は、EGM-2 Endothelial SingleQuots Kit (Lonza、CC-4176) の成分を補充した EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 (Lonza、00190860) で培養しました。 MRC-5細胞は、20％FBSおよび1％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Gibco、11995-065）中で培養した。 HUES-9およびXCL-1細胞は、mTeSR培地(Stemcell Technologies)中のMatrigel(Corning)でコーティングされた6ウェルプレート上で維持された。 すべての細胞株は、5% CO2 雰囲気の加湿インキュベーター内で 37 °C で培養されました。 PCRで確認したところ、すべての細胞培養物にはマイコプラズマは含まれていませんでした。 接触阻害を避けるために、培養物が 40 ～ 50% コンフルエントに達したときに接着細胞株を継代しました。 浮遊細胞株を 2 ～ 3 日ごとに継代しました。 RNA 抽出のために、2 日間の継代後に細胞を収集しました。

血清飢餓処理では、1% ペニシリン ストレプトマイシン (Gibco、15140-122) を添加し、10% 熱不活化 FBS を含まない RPMI 1640 培地 (Gibco、72400-021) で細胞を培養しました。 血清飢餓後の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Sigma、P3813）で洗浄し、トリプシン処理し、3 mM EDTA（Sigma、E9884）を補充した新鮮な培地に再懸濁しました（血清飢餓培養の場合は 10 mg/ml ウシ）血清アルブミン (BSA、Sigma、A7906)。 EDTAおよびBSAをMilliQ水に溶解し、ストック溶液をMillex-GP Millipore Express PES膜フィルターユニット(Millipore)で滅菌濾過した。 Eppendorf MiniSpin遠心分離機(タイプ5452)を使用して細胞を200gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。

接着細胞をトリプシン-EDTA 溶液 (Sigma、T3924) でトリプシン処理し、新鮮な培地に再懸濁しました。 懸濁細胞培養物およびトリプシン処理した接着細胞を、Eppendorf MiniSpin 遠心分離機 (タイプ 5452) を使用して 200 g で 5 分間遠心分離し、PBS で 2 回洗浄しました。 ペレットを、1% β-メルカプトエタノール (Merck) を補充した RLT バッファー (Qiagen RNeasy Plus Mini キットの一部) に再懸濁し、滅菌ガラスビーズを使用して 1 分間ボルテックスすることによって溶解しました。 溶解したサンプルは、さらに処理するまで -20 °C で保管しました。 メーカーの推奨に従って、Qiagen RNeasy Plus Mini キットを使用して RNA を抽出しました。 オンカラム DNase 消化は、RNase-Free DNase Set (Qiagen、79254) を使用して実行されました。 RNAを50μlのヌクレアーゼフリー水(Ambion)で溶出した。 260/280 および 260/230 比で示される濃度と純度は、NanoDrop ND-2000 で測定されました。 次の逆転写反応で等しい RNA 量が測定されることを保証するために、すべての RNA サンプルの濃度を 24 ng/μl に設定し、NanoDrop で検証しました。 RNA サンプルの完全性と潜在的なゲノム DNA 汚染を評価するために、1% アガロース (Sigma、A9539) および TBE ランニングバッファーを使用してアガロースゲル電気泳動を実行しました。 同様に600 ngのRNAをゲルローディング色素（New England Biolabs、B7024S）と混合し、ゲルのウェルにロードしました。 GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific、SM1331) をマーカーとして使用しました。 イメージングには Gel Doc XR + Imager (Bio-Rad) を使用しました。 RNA サンプルは、さらに処理するまで -80 °C で保管されました。

RT 反応の適合性を評価するために、RT-qPCR 用 Maxima First Strand cDNA 合成キット (Thermo Scientific、K1642) と High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems、4,368,814) を比較しました。 キットはメーカーの推奨に従って使用され、RT-qPCR 用 Maxima First Strand cDNA 合成キットの場合、RT 反応は 65 °C で 30 分間実行されました。 HCT 116 細胞から抽出した RNA から一連の 6 点 2 倍希釈液を調製し、開始濃度 1600 ng/μl で RT 反応に導入しました。 さらなる実験のために、RT-qPCR 用の Maxima First Strand cDNA 合成キットを使用し、200 ng RNA を反応に導入しました。 RT 反応は、Applied Biosystems GeneAmp PCR システム 2700 で実行されました。cDNA サンプルは、さらに処理するまで -20 °C で保存されました。

DUT-4 アイソフォームの転写開始部位は、他のアイソフォームの転写開始部位よりも上流にあります (図 1A)。 DUT-4 アイソフォームを検出するために、オレンジ色で示した最初のエクソンにイントロン隣接フォワード プライマーが設計されました。 DUT-M アイソフォームは、DUT-3 アイソフォームと同じプロモーターを共有していると考えられます。これは、これらのアイソフォームの転写が水色で示された同じ位置で開始されるためです。 DUT-M アイソフォームの転写は濃青色の配列で続行されますが、ミトコンドリアのターゲティング配列に対応するこの配列は DUT-3 アイソフォームには存在しません。 DUT-M アイソフォームのイントロンに隣接するフォワード プライマーは、このエクソンで設計されました。 DUT-M と DUT-3 の両方のアイソフォームの転写は、緑色で着色された配列で続行されます。 DUT-3 アイソフォームのイントロンにまたがるフォワード プライマーは灰色で表示されます。 DUT-N アイソフォームの転写は赤色で色付けされた配列から始まり、共通配列に続きます。 DUT-N アイソフォームの検出には、エキソンプライマー設計が適用されました。 図 1B は、dUTPase アイソフォームのタンパク質配列を示しています。 DUT-3 アイソフォームを除くすべてのアイソフォームには、コア核局在シグナル (KRAR)10 が含まれています。DUT-3 アイソフォームの翻訳開始部位は、太字の緑色の共通配列の下流にあります。

また、全体的な dUTPase mRNA 発現レベル (DUT-all) を決定することも目的としました。 すべての dUTPase アイソフォームの共通コード領域は、ホモ・サピエンス ジンクフィンガー プロテイン 534 (ZNF534) 転写バリアント 3 (NCBI RefSeq ID: NM_001291368.4) および 4 (NCBI RefSeq ID: NM_001291369.4) と非常に類似しているため、プライマー ペア共通配列は 3' UTR 領域に位置するように設計されました。 DUT-3 アイソフォームを特異的に増幅するために、フォワード プライマーはエクソン-エクソン接合部に位置するように設計されました (イントロン スパンニング デザイン)。 DUT-4 および DUT-M アイソフォームの場合、フォワード プライマーとリバース プライマーはイントロンで分離されました (イントロン隣接デザイン)。 前述のアイソフォームのプライマー設計により、ゲノム DNA コンタミネーションを増幅する可能性が排除されました。 dUTPase の DUT-N アイソフォームは、エキソンプライマー設計を使用して決定されました。 すべてのターゲットについて、3 つまたは 4 つのプライマーペアを設計し、融解曲線分析およびアガロースゲル電気泳動を組み合わせた温度勾配 PCR と比較して、PCR 製品の特異性を確認しました。 アガロースゲル電気泳動は最適化中に実行され、融解曲線分析は各 PCR 反応後に日常的に実行されました。 特定の生成物はアガロースゲル上で単一の鋭いバンドとして示され、融解曲線分析では単一のピークによって特徴付けられました。 複数のプライマーペアが特定の産物を生成した場合、最も低い Cq 値を持つプライマーペアがさらなる実験のために選択されました。

プライマーペアを設計するには、NCBI プライマー設計ツールを使用しました 53。 PCR 産物の長さは 120 塩基対 (bp) に制限されていました 54。 プライマーの融解温度は 60 ～ 63 °C の範囲に設定されました。 特異性は、次のパラメーターを使用して BLAST で調査しました: 3' 末端の最後の 5 bps 内の少なくとも 3 つのミスマッチを含む、意図しないターゲットに対する合計で少なくとも 5 つのミスマッチ。 6 個を超える不一致があるターゲットは、特異性チェックでは無視されました。 プライマーは、乾式形式で脱塩精製してメルクから注文し、100 μM 溶液を作成するための推奨に従ってヌクレアーゼフリー水に溶解しました。 プライマー溶液の濃度はNanoDropで確認しました。

qPCR 反応は、MyTaq HS Mix (Bioline、BIO-25046)、Evagreen 色素 (Biotium、31000)、ヌクレアーゼフリー水、cDNA テンプレート、および適切なプライマーを使用して、最終容量 10 μL で実行されました。 各 qPCR 反応では、0.1 μl の cDNA サンプルを使用し、すべてのプライマーの最終濃度は 500 nM でした。 すべてのサンプルとすべての標的遺伝子に対して 3 つの技術的複製が使用されました。 各プレート上の各ターゲットについて、テンプレートなしコントロール (NTC) 反応の 2 つの技術的複製を測定しました。 サンプルの 25% については、逆転写コントロール (NRT) はランダムに測定されませんでした。 NRT コントロールは、RT 酵素と反応バッファーの代わりにヌクレアーゼフリー水を使用して RNA サンプルから調製しました。 NRT/NTC とサンプルの Cq 値の差は、ほとんどの場合で 10 を超え、すべての場合で 5 を超えました。

透明なハードシェル 96 ウェル PCR プレート (Bio-Rad) および Microseal 'B' PCR プレート シーリング フィルム (Bio-Rad) を使用しました。 熱サイクリングおよび検出は、CFX96 リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad) で実行されました。 サーマルサイクリングプロトコルには、95℃で5分間の初期変性とホットスタートポリメラーゼ活性化、その後95℃で30秒間の変性と63℃で30秒間のアニーリング/伸長の50サイクルが含まれます。 増幅後、60 °C から 95 °C まで 5 秒ごとに 0.5 °C ずつ増加して融解曲線分析を実行しました。 dUTPase アイソフォームの同定に使用される PCR 産物の融解曲線を比較するために、温度の増分は 0.2 °C に設定されました。

PCR産物を使用したPCR効率値の決定のために、HCT 116細胞の3つの生物学的複製から抽出したRNAサンプルをプールし、各ターゲットの逆転写反応に導入し、続いて上記のようにqPCRで増幅しました。 PCR産物は、2%アガロースおよびTAEランニングバッファーを使用したアガロースゲル電気泳動で分析されました。 メーカーの推奨に従って、NucleoSpin Gel および PCR Clean-up (Macherey-Nagel、740609) を使用して、PCR 産物をゲルから精製しました。 溶液の濃度は NanoDrop で測定されました。 一連の 7 点 10 倍希釈を調製し、3 回の技術的反復により、最終濃度 100 fg/μl ～ 0.0001 fg/μl の範囲で各濃度ポイントを qPCR 反応に導入しました。 Cq 値を、濃度と曲線の傾きを 10 を底とする対数に対してプロットし、回帰係数を決定し、PCR 効率値を式 E(%) = [10^(1/-傾き)- で計算しました。 1]*100%。 PCR産物の測定から得られたPCR効率値をさらなる計算に使用しました。

また、2 つの dUTPase ターゲット、DUT-N および DUT-all の cDNA サンプルを使用し、前回の記事では参照遺伝子ターゲット IPO8、PUM1、SNW1 の cDNA サンプルを使用して PCR 効率値を決定しました。 この目的のために、HCT 116 細胞の生物学的複製に由来する cDNA をプールし、6 点 4 倍希釈系列を調製しました。 最も濃縮されたポイントには、各ウェルに 0.3 μl の cDNA が含まれていました。 各ターゲットおよび各濃度ポイントに 3 つの技術的反復が適用されました。 結果は上記のように評価されました。

最初に PCR 産物の特異性を検証するために、HCT 116 細胞の生物学的複製に由来する cDNA をプールし、qPCR 反応に導入しました。 サンガー配列決定は、各 dUTPase アイソフォームのより長い PCR 産物に対して実行されました。 次のリバース プライマーと各 dUTPase ターゲットの適切なフォワード プライマーを使用して、より長い PCR 産物を生成しました: 5'-TGGTATTGTGTAATCATAGGCACTGT-3'。 これらの標的をテンプレートとして使用して、第 2 ラウンドのネステッド PCR を実行し、アガロースゲル電気泳動および融解曲線分析を使用して、PCR 産物をシングルラウンド PCR 反応からの PCR 産物と比較しました。 アガロースゲル電気泳動には、2% アガロースおよび TAE ランニングバッファーを使用しました。 各遺伝子について、2 ～ 4 μl の PCR 産物をローディング色素と混合し、ゲルにロードしました。 GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder および GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific、SM0321) をマーカーとして使用しました。 イメージングにはGel Doc XR + Imagerを使用しました。 融解曲線分析は各増幅後に実行されました。 融解曲線が非特異的な生成物の形成を示した場合、ウェルは分析から除外されました。

細胞周期相の分布をフローサイトメトリーで分析しました。 細胞を10μM濃度の5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)で20分間処理した。 細胞を上記のように収集した。 DNA合成のための細胞の染色は、メーカーの推奨に従って、Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 フローサイトメトリーアッセイキット (Invitrogen、C10632) を使用して実行されました。 細胞は、500 μl PBS 中の 10 μg/ml ヨウ化プロピジウム (Thermo Scientific) および 20 μg/ml RNase A (Sigma、10109142001 を 10 mM Tris-HCl、15 mM NaCl、pH = 7 に溶解) で DNA 含有量についても染色しました。遮光して室温で 30 分間インキュベートします。 サンプルは Attune NxT フローサイトメーター (Thermo Fischer Scientific Waltham、MA、米国) で分析されました。 Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 シグナルは、BL1 チャネルで 488 nm 励起および 530/30 nm 発光で検出されました。 ヨウ化プロピジウムシグナルは、BL3 チャネルで 488 nm 励起および 695/40 nm 発光で検出されました。 結果の分析は、Attune NxT 3.2.1 ソフトウェアを使用して実行されました。

RIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% Nonidet P-40 Substitute、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、50 mM TRIS HCl、2 mM DTT、1 mM PMSF、5 mM）中で1分間ボルテックスすることにより細胞を溶解しました。ベンズアミジン、2 mM EDTA）に cOmplete ULTRA Tablets (Roche) および PhosSTOP (Roche) を補充しました。 ライセートを脱気機能を使用して 4 °C (Elma S 30 H Elmasonic) で 3 分間超音波処理を 2 回行い、4 °C、10621 g (Eppendorf Centrifuge 5804 R) で 5 分間遠心分離しました。 上清を収集し、さらに処理するまで -20 °C で保存しました。 サンプルのタンパク質濃度は、BioTek Synergy Mx Microplate Reader を使用して Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific、23227) で測定しました。 3.5 μl ローディングバッファー 5X (250 mM Tris-HCl、50% グリセロール、10% DTT、10% SDS、0.05% ブロモフェノール ブルー、pH = 6.8) および RNase フリー水を加えた後、総タンパク質 15 μg を各ウェルにロードしました。最終容量は 17.5 μl です。 サンプルを 95 °C で 5 分間インキュベートし、16% ポリアクリルアミドゲルにロードしました。 GRS Protein Marker Multicolor (GRiSP、GLP01.0500) をプロテインラダーとして使用しました。 電気泳動は、Mini-PROTEAN 電気泳動システム (Bio-Rad) を使用し、トリス-グリシン SDS ランニングバッファー (25 mM トリス-HCl、20 mM グリシン、0.1% SDS) 中で 200 V で 90 分間実行しました。 転写には、イモビロン-P 孔径 0.45 μm PVDF 転写膜 (Merck、IPVH09120) を転写緩衝液 (10 mM CAPS、15% メタノール、pH = 11) とともに 250 mA で 3 時間使用しました。 膜を濾紙上で乾燥させ、移送後に切断し、ＴＢＳ－Ｔ（２５ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ＝７．４）中に置いた。 ブロッキングおよび免疫染色は、TBS-T 中の 5% 脱脂粉乳中で実行されました。 1 時間のブロッキング後、一次抗体とのインキュベーションを一晩実行しました (ウサギで産生された抗アクチン (20-33) ポリクローナル抗体 (Sigma、A5060)、ラットで産生された抗 dUTPase モノクローナル抗体 (Sigma、SAB4200044))。 メンブレンを TBS-T で 10 分間 3 回洗浄した後、光から保護しながら二次抗体とのインキュベーションを 2 時間実行しました (アクチンには抗ウサギ IgG (GE Healthcare、Na934vs)、アクチンには抗ラット IgG (Sigma、A9542)) dUTPase)。 メンブレンを再度TBS-Tで10分間3回洗浄した後、イメージングまでメンブレンをTBSバッファー中に入れました。 バンドは、Immobileon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck、WBKLS0100) で視覚化しました。 イメージングは​​ ChemiDoc MP イメージング システム (Bio-Rad) を使用して実行されました。

遺伝子発現解析には、CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) ソフトウェアを使用しました (URL: https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-maestro-software-for-cfx-real) -時間-PCR-機器)。 閾値は、測定した各プレートの相対蛍光単位 (RFU) 500 に均一に設定されました。 ゲル画像は、Image Lab 4.1 ソフトウェア (Bio-Rad) (URL: https://www.bio-rad.com/en-hu/product/image-lab-software) でキャプチャされました。 グラフはOriginPro 2018（OriginLab Corp.）（URL：https://www.originlab.com/2018）で作成しました。 個々のグラフからの図の作成には、CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) を使用しました (URL: https://www.coreldraw.com/en/product/coreldraw/)。

全体的な発現に対する dUTPase アイソフォームの相対的な正規化された発現の関係を評価するために、各正常細胞株と癌細胞株のグループの間でペアワイズ比較を実行しました。 相対的に正規化された発現データは、CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) から抽出されました。 全体の発現 (DUT-all ターゲットで測定) に対する各アイソフォームの相対正規化発現の比の対数を計算し、比指標と呼びます。 異なる細胞株で測定された 3 つの生物学的複製サンプルの分散は等しくないため、XLSTAT (Lumivero) を使用してボンフェローニ補正を使用したノンパラメトリックのクラスカル・ワリス分析とそれに続くコノバー・イマンのペアワイズ比較を実行しました。 ボンフェローニ補正後、p 値は 0.0018 未満で有意であると定義されました。 血清飢餓実験では、CFX Maestro ソフトウェアによって p 値を計算しました。

現在の研究ではデータセットは生成または分析されませんでした。 リクエストに応じて、電子メール アドレス [email protected] 経由で生データを入手できます。

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この研究は主にハンガリー国立研究開発イノベーション局（K119493、K135231、VEKOP-2.3.2-16-2017-00013からBGV、NKP-2018-1.2.1-NKP-2018-00005）によって支援されました。 TKP2021-EGA-02助成金は、ハンガリー文化イノベーション省による国立研究開発イノベーション基金からの支援を受けて実施され、TKP2021-EGA資金計画に基づいて資金提供されています。 この研究は、ハンガリー科学研究基金 (VGy への OTKA-K128011 および AÁ への OTKA-K128369) によっても支援されました。 この研究は、ハンガリーのテーマ別エクセレンスプログラム（TKP2020-NKA-26）によっても支援されました。 著者らは、National Laboratories Excellence プログラム (National Tumorbiology Laboratory Project (2022-2.1.1-NL-2022-00010 to JT) のもと) および Hungarian Thematic Excellence Program (TKP2021-EGA-44 to JT) からの財政的支援を認めています。 著者らは、Beáta Harszti の技術支援に感謝します。

ブダペスト工科経済大学が提供するオープンアクセス資金。

BME ブダペスト工科経済大学 Műegyetem Rkp. 化学技術およびバイオテクノロジー学部、応用バイオテクノロジーおよび食品科学科 3.、ブダペスト、1111、ハンガリー

ゲルゲリー・アッティラ・ラチュ & ベアタ・G・ベルテシー

酵素学研究所、自然科学研究センター、ELKH エトヴェシュ ロラン研究ネットワーク、ブダペスト、ハンガリー

ゲルゲリー・アッティラ・ラチュ、ニコレット・ナジ、ジェルジ・ヴァラディ、アゴタ・アパティ、ベアタ・G・ベルテシー

ELTE Eötvös Loránd University、生物学博士課程、生物学研究所、1117 Budapest Pázmány Péter Sétány 1/C、ブダペスト、ハンガリー

ニコレット・ナジ

国立腫瘍研究所、実験薬理学部、Ráth Gy。 U. 7-9、ブダペスト、1122、ハンガリー

ヨジェフ・トヴァーリ

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GAR と BGV がプロジェクトを発案し、実験を設計しました。 GAR と NN は実験を実行し、結果を分析しました。 BGVがプロジェクトを監修しました。 JTとA.A. 正常な細胞株を培養するための材料と専門知識を提供しました。 GV はフローサイトメトリー分析を実行しました。 GAR、NN、BGV が原稿を書きました。 著者全員が原稿をレビューし、批判的なフィードバックを提供しました。

Gergely Attila Rácz または Beáta G. Vértessy への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Rácz、GA、Nagy、N.、Várady、G. 他ヒト DUT 遺伝子の 2 つの新しいアイソフォームの発見。 Sci Rep 13、7760 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1

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受信日: 2022 年 6 月 30 日

受理日: 2023 年 4 月 5 日

公開日: 2023 年 5 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1

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