プロバイオティクスによるクオラムセンシングの破壊は毒性を低下させ、メチシリン中のセフォキシチン感受性を高める

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4373 (2023) この記事を引用

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メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の病原性を制御するクオラムセンシング（QS）システムを標的とする治療法は、抗生物質の有望な代替品である。 QS システムは、MRSA の抗生物質耐性、外毒素産生、抗酸化物質の保護、免疫細胞の回避の制御において重要な役割を果たしており、したがって病原体の毒性を軽減するための魅力的な治療標的となります。 本研究では、2 つの乳酸菌株から単離された生理活性ペプチドの効果が、2 つの臨床 MRSA 分離株における抗生物質耐性、カロテノイド産生、酸化的死滅に対する耐性、およびバイオフィルム構造に対して試験されました。 バルクおよび半精製生理活性分子を用いた分別阻害濃度アッセイから得られた結果は、セフォキシチンを介した MRSA の死滅を増加させる顕著な相乗効果を示しました。 これは、主要な膜色素スタフィロキサンチンの 6 分の 1 の減少と、酸化ストレス媒介死に対する感受性の 99% 増加と結びついています。 QS 遺伝子 agrA および luxS のリアルタイム定量 PCR 分析により、MRSA 株間で発現の差異が見られ、溶血素遺伝子 hla の有意な下方制御が示されました。 光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡により、バイオフィルム形成およびクラスター化挙動の変化が明らかになった。 これらの結果は、生理活性代謝物をβ-ラクタム系抗生物質と併用して効果的に適用し、MRSAをセフォキシチンに対して感作させることができることを実証している。 さらに、これらの結果は、QS によって制御されるいくつかの重要な毒性メカニズムがプロバイオティック代謝産物によって減少することを示しました。

抗生物質の過剰使用は歴史的に、新たな耐性菌を選択することで抗生物質耐性菌の増加に寄与してきました1。また、抗生物質の単独療法への依存が新たな耐性菌株に対して追いつくことができるとはもはや期待されていません2,3。 抗菌薬耐性の拡大を管理するための 1 つの戦略は、確立された抗菌薬の使用を制限することで、耐性の出現に寄与する選択圧を下げることです。 その結果、従来の抗生物質の単剤療法に代わる研究に重点が置かれています3,5。 特に、細菌のクオラムセンシング（QS）と細胞間コミュニケーションを妨げる代替治療法は、抗菌薬耐性の広がりをより適切に管理するための有望なアプローチです。 細菌の QS システムは、感染時の宿主の変動する環境に病原性遺伝子の発現を適応させることにより、細菌の病因を助ける高度に洗練された制御機構を使用します。 病原体密度が低い場合、細胞間の通信に使用されるシグナル伝達分子の濃度は低くなりますが、細胞集団密度が増加するにつれて閾値濃度まで蓄積します。 閾値に達すると、QS シグナル伝達分子が特定のトランスポーターを介して細胞に取り込まれ、転写調節因子が活性化され、それが病因のその段階で必要な病原性遺伝子を誘導します6。 QS システムは必須の代謝プロセスには直接関与しておらず、少なくとも理論的には、これらの非殺傷性代替法は、耐性を発現する能力を持つ病原体に対してそれほど選択的圧力をかけることはありません 7,8。 さらに、QS システムは、毒素産生や免疫細胞回避など、全体的な毒性に寄与する細菌の典型的な特性や行動において重要な役割を果たしていることが多いため、QS 破壊物質は細菌感染や敗血症との戦いにおける興味深い治療候補となっています 9,10。

病原性細菌と戦うための候補として最近浮上したそのような新しい代替法の 1 つは、QS 破壊物質として機能するプロバイオティック細菌とその代謝産物の使用です。 人間や動物の健康に対するプロバイオティクスの利点の主張を裏付ける科学的証拠は不足していますが、最近の研究により、プロバイオティクスが病原体の毒性を直接妨害するように作用するいくつかのメカニズムが解明されました。 ラクトバチルス・アシドフィルスによって産生される代謝ペプチドは、病原性細菌株が環境を感知して伝達するためのQSの使用を減らすことにより、病原性細菌株の病原性を軽減することが示されています。QSは、毒素を産生し、宿主細胞に侵入し、免疫細胞を回避し、病原体の能力に大きく貢献します。バイオフィルムを形成します11、12。 ビフィズス菌培養物の無細胞使用済み培地 (CFSM) から単離された代謝物は、サルモネラ エンテリカ血清型ネズミチフス菌および腸管出血性大腸菌 O157:H713,14 の付着と接着に必要な病原性因子を制御する主要な調節遺伝子を下方制御することも示されています。 注目すべきことに、プロバイオティクスである枯草菌が、タイの農村部の腸内で共生病原体である黄色ブドウ球菌の排除に大きく貢献するクエンチング代謝産物を生体内で生成することが示されている15。

黄色ブドウ球菌は、重大な懸念のあるグラム陽性病原体です。 グラム陽性菌は、細胞間 QS 制御遺伝子発現系で自己誘導オリゴペプチドを利用しており、これらの不透過性自己誘導物質を介したコミュニケーションは特殊な受容体によって媒介されます。 アクセサリー遺伝子調節因子 (agr) 経路は、黄色ブドウ球菌において最もよく説明されている QS システムの 1 つであり、2 成分受容体ヒスチジンキナーゼ (AgrC) とその転写応答調節因子 (AgrA) で構成されます16。 agr システムは細胞集団密度の影響を受け、感染のさまざまな段階で黄色ブドウ球菌の要求に応じて病原性発現を制御します 17。 また、AgrA は、酸化ストレスや免疫細胞回避に対する黄色ブドウ球菌の防御に重要な酸化感知能力を備えていること、また、agr システムは、α 溶血素や細胞表面などの外毒素の密度依存性制御に不可欠であることも示されています。タンパク質発現19,20。 以前の研究では、agr システムが、毒性の高い市中感染メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) のメチシリン耐性を制御する mecA 遺伝子に対して顕著な調節効果を示すことも示されています 21,22,23。 したがって、agr システムは、黄色ブドウ球菌における QS 破壊および新規治療介入の重要な候補として考慮されるべきであると提案されています9。 2 番目の QS 調節システムは代替シグマ因子 B (sigB) で、黄色ブドウ球菌を含む多くのグラム陽性菌のストレス応答システムを調節します。 SigB はカロテノイド生合成や抗生物質耐性機構などの毒性形質も制御します 24。 さらに、MRSA 株における sigB の欠失により、メチシリンやオキサシリンなどの細胞壁活性抗生物質に対する感受性が増加しました 25。 したがって、興味深いアイデアは、新規併用療法として、非抗生物質の QS 破壊分子を確立された抗生物質と組み合わせて応用することです。

プロバイオティクス細菌によって産生されるQS破壊物質は、効果のない抗生物質が特定のMRSA株に対してより効果的な状態に戻るのを助けることにより、抗菌薬耐性との戦いに利用できる可能性があると提案されている。 さらに、MRSAには複数のQSシステムが包括的に制御されているため、MRSAの病原性（例えば、オキシダント生存）に大きく寄与するQS制御因子の破壊も、これらのプロバイオティック代謝産物によって達成される可能性がある。 病原性低減におけるプロバイオティクス化合物の潜在的な能力を分析するために、プロバイオティクス乳酸菌（LAB）Enterococcus faecium NCIMB 30616（「Ef 30616」）の無細胞使用済み培地（CFSM）を選択しました。 乳酸菌の2番目のプロバイオティクス株、ラクトコッカス・ラクティスATCC 11454(「L111454」)もまた、その効果が多くのプロバイオティクス種の間で保存されているかどうかを調べるために調査された。 さらに、MRSA の 2 つの臨床分離株が、高毒性 MRSA 集団でよく説明されているいくつかの重要な病原性因子 20: スタフィロキサンチンとカロテノイドの合成 23、α溶血素の産生、過酸化水素生存率の増加とオキシダント死滅に対する耐性 23,26、所持などの減少を比較するためのターゲットとして選択されました。抗生物質耐性機構および SCC 上に位置する mecA 遺伝子の制御および発現のための遺伝子を含む、移動性遺伝要素であるブドウ球菌カセット染色体 (SCC) の解析。

プロバイオティクス材料の効果を調査するために、まず、2 つの臨床 MRSA 株、81M 株 (「MRSA 81M」) および 414M 株 (「MRSA 414M」) の個々の最小発育阻止濃度 (MIC) を、β-ラクタム系抗生物質セフォキシチンに対して測定しました。その結果、各株のセフォキシチン MIC はそれぞれ 100 μg/mL および 60 μg/mL となりました。 セフォキシチンは、MRSA 株における抗生物質耐性の SSC mecA (PBP2a) 経路を強力に上方制御することが示されているため、この抗生物質がこの研究に選択されました 28。 生理活性代謝物 (5、30、および 60 mg/mL) を含むフィルター滅菌済みの 3 つの濃度の Ef 30616 バルク CFSM をチェッカー盤状に添加し、セフォキシチン濃度範囲 (0 ～ 100 μg/mL) に等しい開始接種材料を加えました。それぞれのMRSA株。 結果は、生理活性代謝物と24時間インキュベートした場合、MRSA細胞密度を90％以上減少させるのに必要なセフォキシチンの最小濃度が濃度依存的に減少することを示しています（図1a、b）。 分別阻害濃度 (FIC) 指数を使用して、非抗菌性生理活性化合物とセフォキシチンの組み合わせの効力を評価しました 29。 FIC は、2 つ以上の抗生物質の組み合わせ、または抗生物質と非抗生物質の化合物の組み合わせの効果を説明するために使用される数式です。 効果は、FIC インデックス 30 で定義されるように、拮抗的、無関心、相加的、または相乗的として説明される場合があります。 セフォキシチンと Ef 30616 生理活性物質の間の FIC 計算の結果を決定するための基準指標は、次のように実装されました。組み合わせが個々の成分で観察された相加効果 (FIC ≤ 0.5) を超えた場合、相乗効果が観察され、相加効果が観察されました。は個々の成分の効果の合計で観察され（FIC > 0.5 ～ 1.0）、その組み合わせが最も活性な成分から観察された効果と等しい場合（FIC > 1.0 ～ 2.0）は無関心な結果が観察され、拮抗的な結果は観察されました。 2 つの化合物の組み合わせが、最も活性の高い個別成分と比較して効果が低下した場合 (FIC > 2.0)、結果が観察されました。 MRSA 81Mおよび414Mの両方について得られたFICは、Ef 30616生理活性代謝産物の濃度の増加に伴うFIC値の逆相関を示します（図1c）。 株８１Ｍのみが、試験したすべてのＣＦＳＭ濃度で相乗的なＦＩＣ値を示し、未処理のＣＦＳＭ対照と比較して３０および６０ｍｇ／ｍｌの両方でＭＩＣが有意に減少した（ｐ＜０．０００１、ダネット多重比較検定）。 しかし、株 414M には相加的な効果しかなく、使用した CFSM のどの濃度でも MIC に有意な差は生じませんでした。 したがって、この研究の MRSA の 2 つの株は、セフォキシチンで処理した場合に生理活性物質に対する感受性が異なり、CFSM および/または抗生物質耐性に対する反応における株特異的な違いを示しています。

β-ラクタム系抗生物質セフォキシチン (0 ～ 100 μg/mL) と Ef 30616 生理活性代謝物 (0、5、30、および 60 mg/mL) の併用試験による、2 つの代表的な臨床 MRSA 株の MIC 増殖阻害パーセントのヒート プロット: (a) MRSA 81M の MIC 熱プロット、(b) MRSA 414M の MIC 熱プロット。 (c) MRSA 株 81M および 414M に対する EfMSI1 生理活性代謝産物とセフォキシチンの併用効果の FIC 指数値。 (d) セフォキシチン (0 ～ 100 μg/mL) と Ef 30616 生理活性代謝物 (30 mg/mL) MWCO 3000 濾液 (つまり < 3000 Da) および保持液の併用試験における MRSA 81M の増殖阻害パーセントのヒートプロット (すなわち > 3000 Da) (n = 3)。 生物学的複製の平均をヒートマップに示し、増殖阻害パーセントの平均値として示します (ANOVA、p < 0.05 ダネット多重比較検定)。

FIC 値の決定に続いて、MRSA 81M は生理活性物質に対する感受性が高く (上記参照)、すべての試験濃度で相乗的な FIC 値を示したため、さらなる MIC 試験に選択されましたが、MRSA 414M は同様のパターンを発現しませんでした。 30 mg/mL の生理活性物質の濃度は、0.5 を大きく下回る FIC 値を有する最低濃度であるため選択されました。 Ef 30616 生理活性物質は、3000 ダルトン (Da) 分子量カットオフ (MWCO) 遠心フィルターを使用して 2 つの画分に分割されました。最初の画分には濾液 (< 3000 Da) のみが含まれ、2 番目の画分には洗浄済みの濾液のみが含まれます。再懸濁保持液 (> 3000 Da)。 チェッカーボード法を再び使用して、同じ開始接種材料とセフォキシチン濃度（0 ～ 100 μg/mL）の同じ組み合わせを使用して MRSA 81M 株の MIC を決定しました。ろ液でも同様の MIC 低下パターンが見られました（図 1）。 1d）。

バルクおよび分画された CFSM の両方で見られた MRSA 81M MIC 値の低下は、有機酸などの LAB によって生成される阻害分子ではなく、生理活性ペプチドによるものであることを確認する必要がありました。 分取サイズ排除クロマトグラフィー (SEC-FPLC) を使用して、バルク CFSM を特定の代謝産物を含む画分に分離し、小さなペプチドが画分 4 (「ペプチド画分」) に溶出しました。 各 SEC 画分を元の CFSM の 5、15、または 30 mg/mL に相当する濃度に再懸濁し、セフォキシチンによるチェッカーボード滴定でテストして、MRSA 81M MIC に対する効果を測定しました。 1 つまたは複数の画分に生理活性代謝物が豊富に含まれている場合、物質の濃度が低い場合でも、強力な相加効果または相乗効果が見られるはずです。

結果は、Ef 30616 画分 4 が濃度依存的に MRSA 81M MIC を低下させることができたことを示しています (図 2a)。 FIC インデックス値は、材料の 15 および 30 mg/mL では相乗的であり、5 mg/mL では相加的でした (図 2b)。 この画分には有機酸が含まれていないため、その効果は含まれる小さな生理活性ペプチドによるものであると結論付けることができます。 画分 3 も 81M MIC 値を減少させることがわかりましたが、これは使用した最高濃度でのみ相乗効果がありました (図 2b、補足図 S1)。 画分1も画分2も細菌のMICには影響を及ぼさず（補足図S1）、小さなペプチドがセフォキシチンに対するMRSA 81M耐性の低下に関与する生理活性分子であることがさらに確認されました。

セフォキシチン (0 ～ 140 μg/mL) および (a) Ef 30616 または (b) Ll 11454 からの SEC 画分 4 と同等のバルク 5、15、および 30 mg/mL と組み合わせた MRSA 81M の MIC 増殖阻害パーセントのヒート プロット材料。 (c) Ef 30616 フラクション 1 ～ 4 および (d) L1 11454 フラクション 1 ～ 4 の FIC インデックス値。 生物学的複製の平均をヒートマップに示し、増殖阻害パーセントの平均値として示します (ANOVA、p < 0.05 ダネット多重比較検定)。

2番目のプロバイオティクス細菌であるL. lactis 11454からの分画された生理活性物質も、FICアッセイでMRSA 81Mに対してテストされ、ペプチド画分もMIC値を低下させることがわかりました（図2c）。 試験したすべての濃度でL111454ペプチドとセフォキシチンの相乗効果があり、未処理の対照と比較してMICが有意に減少した(図2d)(p<0.0001、ダネット多重比較検定)。 興味深いことに、Ef 30616 画分 4 には同等の L1 11454 画分よりもタンパク質性物質が少ないにも関わらず、Ef 30616 物質はセフォキシチン中での MRSA 81M 増殖を依然として大幅に減少させ、この効果に関与するペプチドは低濃度で強力であり、ほんの一部しか構成していないことを示唆しています。材料中の総タンパク質の割合。 これらの結果から、プロバイオティクス発酵から生じる小さな生理活性ペプチドが MRSA 抗生物質耐性を低下させることができることが実証されています。

細胞が抗生物質などの環境ストレス因子に曝露されると、黄色ブドウ球菌培養液中に小型コロニー変異体（SCV）の集団が発生する可能性があります31。 このような SCV は、生理活性処理した MRSA 培養物を血液寒天プレート上に播種したときに観察されました。 37 ± 1 °C で 24 時間インキュベートした後、生理活性物質で処理した MRSA 81M をプレーティングすると、溶血リングがほとんどまたはまったく見えない小さな白いコロニーが明らかになりました。 比較すると、未処理の81M野生型コロニーはほとんど均一であり、独特のオレンジ色と溶血表現型を維持していました（図3a、b）。 合計 30.9% の MRSA 81M コロニーがオレンジ色の色素を完全に失い、SCV として現れました。 同様のパターンがMRSA 414Mでも見られましたが、カウントされた総コロニーのうち色素沈着を失ったのはわずか19.5%でした(図3c)。 元の生物活性処理された SCV を再度画線し、血液寒天プレート上で増殖させた場合、SCV 表現型は保持されました (補足図 S2)。 すべての対照は、血液寒天培地での増殖または汚染について陰性でした。

(a) 30 mg/mL Ef 30616 生理活性物質で処理した後の血液寒天上で増殖した MRSA 81M のコロニー (左) または無処理 (右)、および (b) 30 mg/mL で処理した後の血液寒天上で増殖した MRSA 414M のコロニーE 30616 生理活性物質あり (左) または無処理 (右)。 矢印は、カロテノイド色素沈着が欠如し、溶血が低下している SCV を示します。 （ c ）Ef 30616生理活性物質（30 mg / mL) (U = 0; p < 0.05; Mann-Whitney)。 中央の黒いバーは平均を示し、上ヒゲと下ヒゲはそれぞれ最大値と最小値を示します。

Ef 30616生理活性代謝産物とともに37℃±1℃で24時間インキュベートした後、81M株細胞は全体的にオレンジ色の大幅な減少を示したことが観察されました（図4a）。 一方、MRSA 414M は色素沈着をほとんど示さなかった（図 4b、c）。 メタノール抽出によるカロテノイドの定量と 450 nm (A450) での吸光度測定により、81M 細胞の処理間の吸光度で測定したカロテノイド濃度には 6 倍の有意な差があったが、カロテノイド濃度の差は 3 倍未満であったため、目視観察が裏付けられました。 MRSA 414M細胞の処理間のカロテノイド（U = 0; p < 0.05; Mann-Whitney）（図4d）。 カロテノイド合成が減少すると、Ef 30616 生理活性代謝産物が酸化剤による死滅に対する MRSA 株の感受性を高めるのではないかという仮説が立てられました。 過酸化水素を 1.5% v/v でそれぞれの MRSA 株の未処理および生理活性処理した培養液に添加し、PBS 溶液中で 37 °C ± 1 °C で 1 時間インキュベートしました。 細胞数（CFU/mL）は、1時間のインキュベーションの前後の両方で測定されました（補足図S3）。 生理活性処理細胞は、MRSA 株 414M および 81M に対してそれぞれ 99.67% および > 99.99% の細胞死を示しました (W = 0; p < 0.05; Wilcoxon signed-rank)。 未処理の414M細胞と81M細胞は、それぞれ16.67％と19.70％の細胞死しか示さなかったのとは対照的に（図4e）。 しかし、未処理の 414M の減少は有意とはみなされませんでした (W = 5; p > 0.05; Wilcoxon signed-rank)。

MRSA 細胞ペレットは、Ef 30616 生理活性物質 (30 mg/mL) と 37 °C ± 1 °C で 24 時間インキュベートした後、カロテノイド色素沈着を示しません: (a) 未処理 MRSA 81M (左) および生理活性処理 MRSA 81M (右) ペレット、 (b) 未処理 MRSA 414M (左) および生物活性処理 MRSA 414M (右) ペレット、(c) 4 つのペレットすべての比較 (左から右へ) 未処理 MRSA 81M、生物活性処理 MRSA 81M、未処理 MRSA 414M、および生理活性処理されたMRSA 414M。 （ d ）両方の株について記載されている2つの処理のそれぞれからの450 nm（A450）でのカロテノイド吸光度測定（n = 3）（U = 0; p < 0.05; Mann-Whitney）。 （ e ）PBS溶液の有無にかかわらず、37°C​​±1°Cで1時間インキュベートした後のMRSA 81M（n = 3）およびMRSA 414M（n = 3）の1.5％v / v過酸化水素に対するブドウ球菌の生存率の減少率。 Ef 30616 生物活性処理 (30 mg/mL) (W = 0; p < 0.05; Wilcoxon の符号付きランク)。 中央の黒いバーは中央値を示し、箱ひげ図 (d) と (e) の上部と下部のひげのキャップはそれぞれ最大値と最小値を示します。

QS と Ef 30616 生物活性物質によって影響を受ける可能性のある病原性遺伝子発現との関係を示すために、相対的な mRNA 発現の分析が実行されました (図 5)。 sigB を含む多くの QS 関連システムは、指数関数的増殖期後期でより高度に活性化されることが示されている 24 ため、それぞれの株の指数関数的増殖期後期および定常期初期で選択した遺伝子の発現をモニタリングしました。 アクセサリー遺伝子制御因子 (Agr) QS システムは、転写応答制御因子 argA について、未処理の対照と比較して有意な差次的な発現を示さなかった。 遺伝子 asp23 は、前述のように SigB 活性の指標としてモニタリングされ 32、その結果は、Ef 30616 プロバイオティクス代謝産物が、MRSA 株 414M および 81M において SigB を介してクオラムセンシングに関連する重要な遺伝子に軽度に干渉することを示しています。

Ef 30616 生理活性物質 (30 mg/mL) と 37 °C ± 1 °C でインキュベートした後の MRSA 株 81M および 414M の未処理対照と比較した MRSA 病原性関連遺伝子の差次的発現。 培養物を対数期後期および定常期までインキュベートしました。 16s rRNA をハウスキーピング遺伝子として使用しました。 データは平均として示され、棒は標準偏差を示します (n = 3)。 株間の統計的に有意な差は星印で示されます (ANOVA; p < 0.05)。

α溶血素をコードするhlaの発現は、定常期、特に414M株において強く下方制御されていた。 これは、血液寒天プレート上の SCV で見られたように、生理活性代謝物が溶血を減少させていることをさらに証明します。 興味深いことに、スタフィロキサンチン生合成の最初のステップを触媒する役割を担うデヒドロスクアレンシンターゼをコードする crtM は、定常期の初期に 81M 株でわずかに上方制御されているように見えましたが、414M の下方制御は非常に低レベルでした。 qPCR の結果は、生理活性物質による治療に応答した 2 つの MRSA 株間の病原性遺伝子発現の違いを示しています。

30 mg/mL のプロバイオティクス代謝産物の存在下および非存在下でインキュベートした MRSA 81M および 414M 株を、37 °C ± 1 °C で 4、6、および 24 時間インキュベートした後、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して評価しました。 SEMイメージングにより、生理活性処理したMRSA 81M株と414M株の両方が6時間のインキュベーションで凝集し始め、未処理の細胞（図6a〜c、g〜l）と比較して、徐々に多層構造を形成し始めたことが示されました（図6d〜f、j〜l）。私）。 光学顕微鏡検査により、生理活性物質で処理されたMRSA細胞が集まり始め、より顕著なクラスターを形成し始めたことがさらに示されました（図7d〜f、j〜l）。 対照的に、未処理のMRSA細胞は、多層クラスターを形成せずに、典型的なブドウのようなクラスターを形成しました（図7a〜c、g〜i）。 さらに、生理活性化合物による処理は細胞の形状やサイズに影響を与えないようで、未処理および生理活性処理した MRSA 81M および 414M の両方の個々の細胞が球状に見えました。

37 °C ± 1 °C で 24 時間インキュベートし、次の間隔で画像化した未処理および生理活性処理 MRSA 81M および 414M 培養物の両方のバイオフィルム形成の進行を示す走査型電子顕微鏡写真: (a) の未処理 MRSA 414M 画像4 時間、(b) 6 時間および (c) 24 時間、Ef 30616 生理活性処理 MRSA 414M (d) 4 時間、(e) 6 時間および (f) 24 時間、未処理 MRSA 81M (g) 4 時間、（ｈ）６時間および（ｉ）２４時間、ならびに（ｊ）４時間、（ｋ）６時間および（ｌ）２４時間におけるＥｆ３０６１６生物活性処理ＭＲＳＡ ８１Ｍ。 倍率 = 4000×。 スケールバー = 20 μm。

37 °C ± 1 °C で 24 時間インキュベートした未処理および Ef 30616 生理活性処理 MRSA 81M および 414M 培養物のさまざまな増殖段階の光学顕微鏡画像。以下の間隔で画像化した: (a) 4 の未処理 MRSA 414M h、(b) 6 時間および (c) 24 時間、(d) 4 時間、(e) 6 時間および (f) 24 時間の生理活性処理 MRSA 414M、(g) 4 時間の未処理 MRSA 81M、(h ）6時間および（i）24時間、および（j）4時間、（k）6時間および（l）24時間でのEf 30616生物活性処理MRSA 81M。 目標 = 10×。 スケールバー = 140 μm。

本研究は、E.フェシウム株30616およびL.ラクティス11454のCFSMから単離された代謝産物が、MRSA感染症に対して臨床的にはもはや適さないβ-ラクタム系抗生物質であるセフォキシチンに対する2つの臨床MRSA株の感受性を高めることを実証している。 セフォキシチンは細菌の細胞壁内のペプチドグリカン層の架橋を阻害することで作用するため、細胞壁成分に対するプロバイオティクス生理活性代謝物の影響は、セフォキシチンの作用機序にとって相乗的に有益です。 我々のデータは、E. faecium Ef 30616およびL. lactis 11454由来の生理活性ペプチドが、抗生物質と組み合わせて非抗菌性アジュバントとして作用する可能性があり、重要なことに、もはや臨床的に関連性のない抗生物質に対してMRSAを「再感作」する可能性があることを示している。セフォキシチンなど。 さらに、我々の結果は、これらのEf 30616生理活性物質が、酸素種に対する耐性、スタフィロキサンチン生合成、黄色ブドウ球菌のQSシステムによって媒介される溶血素の産生など、MRSA感染を支持する病原性形質を妨げる可能性があることも示している。 カロテノイド色素はブドウ球菌の適応度、特に免疫細胞回避に大きく寄与するため、カロテノイド合成の阻害は黄色ブドウ球菌感染症における治療介入の潜在的な標的となる可能性があります27。 最後に、MRSA 集団全体で SVC の濃度が高くなっているということは、成長の後期段階で集団内の重要な QS 関連遺伝子の発現が減少する MRSA 細胞の変化を示している可能性があります。 しかし、バイオフィルム関連の黄色ブドウ球菌感染症に関しては、QS 破壊が SVC の選択と全体的なバイオフィルム形成に利点をもたらすことが示されているため、プロバイオティクスの QS 破壊化合物の導入は有益ではない可能性があります 6,33。

MRSA 81M の FIC 値は、Ef 30616 生理活性物質の 3 つの濃度すべてに対して相乗的な組み合わせ効果があることを示しましたが、MRSA 414M の FIC 値は、使用した最高濃度でのみ相乗効果を示しました。 これらの結果は、2 つの MRSA 株の抗生物質に対する感受性が株特異的に異なることを示しています。 生理活性物質のみの対照ウェルでは、両株の MRSA 増殖に対する負の影響は示されず、生理活性代謝産物の作用機序が本質的に MRSA に対して抗菌的ではなく、MRSA 増殖阻害は Ef 30616 生理活性代謝産物と Ef 30616 を組み合わせた場合にのみ観察されたことが示されました。セフォキシチン。 生物活性画分の MIC 結果は、濾液が最も大きな活性を含み、セフォキシチンの MIC を低下させたことを明確に示しています。 ただし、保持液中にはいくらかの残留活性が検出され、その結果、MIC は未処理の対照よりわずかに低くなりました。 さらに、実行された保持液の2回の洗浄でも、ある程度の残留生物活性活性が示されました（補足図S4）。 これらの結果は、試験した 2 つの MRSA 臨床株に対する生物活性を含む Ef 30616 化合物の大部分のサイズがおよそ ≤ 3000 Da であることを示しています。

バルク物質を化学的に定義された画分に分離することにより、生物活性ペプチドが、観察されたセフォキシチンに対する MRSA 81M 株の抗生物質耐性の低下に関与していることが実証されました。 バルクの CFSM および MWCO 濾液には、残留糖、未加水分解タンパク質、発酵から生じる有機酸など、多くの培地成分が依然として含まれています。 乳酸菌は、環境の酸性化を通じて黄色ブドウ球菌の増殖を阻害することが知られており 34、したがって、セフォキシチンに対する黄色ブドウ球菌の感受性に影響を与える可能性のある有機酸を除去することが不可欠でした。 L111454と比較してEf 30616ペプチド画分には物質がはるかに少ないにもかかわらず、その効果は依然として十分に強く、FIC値の相乗的な減少を引き起こした。 これは、これらのプロテオバイオティクス分子が非常に低い濃度で非常に高い効力で作用する可能性があることを示唆しています。 Kouらによる研究でも同様の結果が観察されている[35]。著者らは、わずか1μg/mLの合成クオラムクエンチング分子でMRSAのMICを初期世代のβ-ラクタム系抗生物質であるナフシリンとセファロチンまで低下させることができることを発見した。 50倍に。 さらに、これらの分子は、マウス MRSA 菌血症/敗血症モデルにおいてセファロチンと組み合わせて適用すると、死亡を減らすのに効果的であることが実証されました 36。 人工ペプチドは、細胞エンベロープの破壊を通じて初期世代の抗生物質の効力を高めるためにも使用されています 37。 我々の結果は、乳酸菌の自然な発酵プロセスを利用して、強力な抗ウイルス活性を持つ生理活性ペプチドを生成できる可能性があることを明確に示しています。

抗酸化カロテノイドによって示される金色の色素は、30 mg/mL の Ef 30616 生理活性代謝物で処理した後の MRSA 81M および MRSA 414M で大幅に減少しました。 注目すべきことに、野生型MRSA 414Mはもともとオレンジ色の色素沈着をほとんど持っていませんでしたが、Ef 30616生物活性物質で処理するとMRSA 414Mは色素の大部分を失い、ほぼ純粋な白色のペレットになりました。 Ef 30616 生理活性代謝物との 24 時間のインキュベーション後の細胞ペレットの色の変化は、プロバイオティクスによる適切な細胞壁構造の破壊を示しています。カロテノイドは、感染および病因発生中の黄色ブドウ球菌膜の安定化、および細胞の剛性の維持にも関与していると考えられています。ホストの防御26,38。 さらに、これらの表面に蓄積した化合物は、光感作や乾燥に対する保護を提供するだけでなく、免疫細胞によって使用される有毒な活性酸素種を抑制する強力な抗酸化物質として作用することによって、黄色ブドウ球菌の全体的な病原性に寄与しています 39。 口語的に知られる「ゴールデンブドウ球菌」MRSA の特徴的な黄オレンジ色の減少は、代替シグマ因子 sigB を含む、黄色ブドウ球菌の過酸化水素耐性に必須であると報告されている QS 関連の 2 つの構成要素システムの破壊による可能性があります。 。 さらに、24時間のインキュベーション後の細胞ペレットの総CFU/mLカウントは、未処理の対照と生理活性物質で処理したMRSA細胞の間でほぼ同じでしたが、細胞ペレットの密度は低く、より大きな細胞ペレットを形成しました（図4a〜c）。顕微鏡イメージングによって明らかになったように、これは、MRSA と生理活性 CFSM 代謝産物とのインキュベーション後の高度なバイオフィルム形成の結果であると考えられます (図 6、7)。 スタフィロキサンチンなどの膜成分の損失は膜の完全性に影響を及ぼし、凝集挙動やバイオフィルム形成の変化につながります。 興味深いことに、生理活性物質で処理した 2 つの MRSA 株は凝集とバイオフィルム形成において高度な進行を示しましたが、どちらも 24 時間にわたってセフォキシチンに対する感受性の増加を示し、凝集とバイオフィルムの生成が MRSA 細胞の複製を助けていないことを示しています。セフォキシチンの存在。 これらの発見は、阻害濃度以下のβ-ラクタム系抗生物質がMRSAにおけるバイオフィルム形成を誘導する可能性があること、また、これらの結果は、生物活性ペプチドによりバイオフィルム形成中であっても抗生物質に対するMRSAの感受性が増加することを実証していることから、極めて興味深い。

興味深いことに、1.5% v/v 過酸化水素とのインキュベーション後、生理活性物質で処理した MRSA 81M と MRSA 414M の両方は、オレンジ色の色素が生理活性物質に残っているように見えたにもかかわらず、それぞれ > 99.99% と 99.67% という細胞死の大幅な減少を示しました。 MRSAを治療しました。 しかし、この低い色素レベルは中間色素 4,4'-ジアポニューロスポレンによるものである可能性があり、これは sigB 中断によって以前に示されています 40。 野生型 MRSA 414M は（MRSA 81M と比較して）カロテノイド産生がほとんどないように見えるため、別の理論として、生理活性代謝産物は酸化環境の感知を担う agr システムの固有成分も破壊できるというものがあります 8。 毒素産生に関しては、hla の転写は MRSA41 の株間で異なり、生理活性物質によるダウンレギュレーションはクオラム センシングのような保存されたメカニズムによる可能性があります。 hla の減少は、生理活性物質での処理後の MRSA コロニーの増殖において表現型的に観察され、両株の血液寒天培地上での溶血リングの強い減少を示しました。 さらに、溶血が減少したコロニーのほとんどは、野生型 MRSA とは異なる形態を示しました。コロニーは小さく、成長が遅く、元の色素沈着のほとんどが失われていました（図 3a、b）。 これらのコロニーは、MRSA 培養において小さなコロニー変異体として以前に報告されています。 agr システムの破壊は野生型 MRSA 集団内の SVC に関連しており、病原性の低下と細胞凝集の増加を示すことが示されています。 まとめると、これらの発見は、特定の Ef 30616 プロテオバイオティクス分子が、重要な抗酸化物質として機能するカロテノイドの産生をブロックすることにより、MRSA における典型的な細胞壁合成を妨害し、結果として酸化剤による死滅に対する感受性を増加させる可能性があるという考えを裏付けるものである。

これらの結果は、自然に生成されたクオラムクエンチング分子が、多剤抗生物質耐性菌の増加に対抗する可能性があることを示しています。 スタフィロキサンチンなどのプロテオバイオティクスを介したMRSA細胞壁構造の破壊により、細菌細胞が活性酸素種の産生を介してマクロファージを介した殺傷を行う可能性が高まるため、宿主免疫応答の有効性が高まる可能性があります。 これらの結果は、他のプロバイオティクス LAB の CFSM 内で見出されるプロバイオティクス代謝産物の QS 破壊活性に関する以前の発見と一致していますが、これらの生理活性代謝産物の完全な作用機序を解明するにはさらなる研究が必要です。 これらの分子がクオラムセンシングによる病原性制御をどのように妨げるかを特定することは、細菌感染を標的とする臨床現場での応用においても重要な意味を持ちます。 しかし、黄色ブドウ球菌の QS システムを妨害するプロバイオティクス細菌から開発されたアジュバント技術は、MRSA 感染症と闘う上で潜在的に重大な候補となる可能性があります。

Enterococcus faecium 30616 (「Ef 30616」) (以前は Lactobacillus acidophilus DSM 13241 株として同定され、MALDI-TOF 微生物同定後に再指定された) の凍結グリセロール保存培養物を、カナダ食品安全研究所 (オンタリオ州グエルフ大学) から入手しました。カナダ）。 このストックプロバイオティクス株は、この研究で使用されるすべての実験でプロバイオティクス代謝産物を含む生物活性物質を生産するために使用されました。 ２番目のプロバイオティック株であるラクトコッカス・ラクティス１１４５４（「Ｌ１１１４５４」）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、ＭＩＣ試験用の生物活性物質を含む物質を製造するために使用した。

黄色ブドウ球菌の 2 つの臨床分離株、MRSA 81M SPA t008 (「MRSA 81M」) および MRSA 414M SPA t034 (「MRSA 414M」) は、プリンス エドワード アイランド大学 (シャーロットタウン) の Atlantic Veterinary College (AVC) から入手されました。 、PE、カナダ）。 両方の株における SCC mecA 遺伝子経路を介したメチシリン耐性の存在は、オキサシリンディスク拡散および mecA 遺伝子プライマーを使用して確認されました (補足表 S1)42。 臨床分離株は、5% v/v 滅菌脱繊維羊血液を補充したトリプシン大豆寒天 (TSA) プレート (Cedarlane、バーリントン、オンタリオ州、カナダ) 上で維持されました。 MRSA 培養物は、すべての実験アッセイのために BBL™ カチオン調整ミューラー ヒントン培地 (Becton, Dickinson and Company、米国メリーランド州スパークス) で増殖させました。

E. faecium Ef 30616を、200 mLの0.22 μmフィルター滅菌改変De Man, Rogosa and Sharpe (MRS)培地(VWR International, Mississauga, Ontario, Canada)に接種した。 このボトル培養物を振盪せずに 37 ± 1 °C で 18 時間インキュベートしました。 次いで、培養物を使用して、２００ｇの乳清タンパク質単離物（カナダプロテイン）および２５ｇの乳糖を４Ｌの既知組成培地（ＣＤＭ）に接種した。 容器培養物を 37 ± 1 °C で 48 時間静的にインキュベートしました。 インキュベーション後、4℃、12,000×gで30分間の遠心分離によりEf 30616細胞を液相から単離した(Avanti J-20 XPI、Beckman Coulter、カナダ)。 次に、プロバイオティクス代謝産物を含む無細胞上清を-80℃で凍結し、凍結乾燥しました。 乾燥したEf 30616無細胞上清は、必要になるまで粉末の状態で-20℃で長期保存しました。

乾燥した上清を秤量し、所望の濃度（5、30、および60 mg/mL）でカチオン調整ミューラーヒントン培地に再懸濁しました。 再懸濁した材料のｐＨをＡｃｃｕｍｅｔ（登録商標）ＡＥ１５０ ｐＨメーター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）でチェックし、必要に応じてｐＨ７．３±０．１に調整した。 次いで、再懸濁した溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて室温で５０００×ｇで１５分間遠心分離した。 残りの液体をデブリペレットから分離し、40/35 Synthware 真空濾過装置 (Kemtech America、ロサンゼルス、米国) を備えた Supor®-800 0.45 μm メンブランフィルター (Pall Corporation、米国ニューヨーク州) で濾過して、液体を除去しました。残りのコロイド物質。 次いで、Ｂａｓｉｘ（商標）２５ｍｍ ０．２μｍシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）を使用して、濾液を濾過滅菌した。 サンプルは必要になるまで -20 °C で保存されました。

再懸濁したプロバイオティック無細胞上清の限外濾過には、分子量カットオフ (MWCO) 3000 Da の Amicon® Ultra 15 mL 遠心フィルター (Millipore Sigma、バーリントン、米国) を使用しました。 上記のように再懸濁した後、10 mL の無細胞上清を MWCO 3000 遠心フィルターチューブに加え、5000 rpm で 1 時間遠心分離しました。 MWCO 3000の濾液を収集した。 残りの保持液画分は、フィルターヘッドを各洗浄ごとに 10 mL のカチオン調整ミュラーヒントン培地で 2 回洗浄することによって収集されました。 2 回のすすぎの後、追加の 10 mL の培地を使用して再懸濁し、残留物を収集しました。 次に、収集したすべての画分を 0.2 μm シリンジフィルターでろ過滅菌し、汚染を除去しました。 MWCO 3000 の液体保持液と濾液の溶液は、実験に必要になるまで -20 °C で保管しました。

乾燥した上清を Milli-Q 水に再懸濁して 50 mg/mL の濃度にし、15 分間超音波処理して可溶化を改善しました。 再懸濁後、サンプルを 8000 x g で 20 分間遠心分離し、上清フィルターを 0.22 μm シリンジフィルターで滅菌しました。 サンプルは、Superdex 30 が充填された XK 26/100 分取カラムで分離され、AKTA Explorer (Cytiva Life Sciences、マールボロ、米国) を使用して分析されました。 物質を10% アセトニトリルおよび0.1% トリフルオロ酢酸を用いて流速3 mL/分で溶離した。 溶出曲線は、pH と 280 および 214 nm での吸光度を測定することによって監視されました。 目的の溶出液を収集し、規定の画分にプールし、-80 °C で凍結し、その後凍結乾燥しました。 凍結乾燥した材料は、必要になるまで -80 °C で保存されました。

2 つの MRSA 株の最小発育阻止濃度 (MIC) 検査に選択された抗生物質は、ブドウ球菌種の MIC 検査に関する臨床検査標準協会 (CLSI) のガイドラインに概説されているセフォキシチンでした 43。 粉末形態のセフォキシチン (Alfa Aesar、Haverhill、USA) を化学天秤で秤量し、10 mg/mL でメタノールに再懸濁し、必要になるまで -20 °C で保存しました。

MIC 検査は、ブドウ球菌種の MIC 検査に関する臨床検査標準協会 (CLSI) のガイドラインに従って実施されました43。 それぞれの臨床MRSA株の一晩培養物を1000倍に希釈して、開始接種材料として約106CFU/mLを得た。 セフォキシチンの希釈範囲は 0 ～ 100 μg/mL でした。 セフォキシチンを含む臨床 MRSA 株 MIC は、Costar® 透明 96 ウェル標準平底マイクロプレート (Corning® Inc.、Corning、USA) のカチオン調整ミューラー ヒントン培地でセフォキシチンを用いたブロス微量希釈によって測定されました。 培地のみのアリコートを無菌チェックとして追加し、バックグラウンドコントロールとして使用しましたが、100 μg/mL のセフォキシチンウェルは抗生物質媒介死滅のポジティブコントロールとして機能しました。 すべての試験サンプルの量は 200 µL/ウェルで、2 連で使用しました。 サンプルの調製と等分に続いて、MIC テストプレートをパラフィルムで密封し、VWR® Incubating Mini Shaker 内で 35 ± 1 °C、200 rpm で振盪しながら 24 時間インキュベートし、温度を Fisherbrand™ デジタル温度計 (Fisher Scientific,ウォルサム、米国）。 インキュベーション後、プレートを室温まで冷却し、SpectraMax M2 マイクロプレートリーダー (Molecular Devices、サンノゼ、米国) を使用して 600 nm の波長で濁度を測定しました。 それぞれの陽性増殖対照と比較して濁度の９０％以上の減少をもたらしたセフォキシチンの最低濃度をＭＩＣとして定義した。 すべての MIC 検査は 3 つの生物学的反復で実行されました。 MIC チェッカーボード試験の後、生理活性物質のサイズと化学的正体をより良く解明するために、生理活性物質の限外濾過と SEC 画分の試験のために、高い MIC を持つ臨床株として MRSA 81M が選択されました。 MWCO 3000 および SEC 画分 MIC 試験は、上で概説した MIC 試験方法と同様に実行されました。

チェッカーボード MIC 分析は、臨床 MRSA 株に対するセフォキシチンとの相乗的、相加的、または拮抗的な組み合わせ効果を決定するために、3 つの事前に決定されたプロバイオティクス生理活性物質の濃度に対して実行されました。 生物活性物質の希釈範囲は、凍結乾燥したEf 30616無細胞上清では5、30、および60 mg/mL、または凍結乾燥したEf 30616およびL111454 SEC画分では5、15、および30 mg/mLであった。 FIC 試験で使用されるセフォキシチンの希釈範囲は、バルク材料では 0 ～ 100 μg/mL、SEC 画分では 0 ～ 140 μg/mL でした。 FIC テストは、上で概説した MIC テスト方法と同じように実行されました。 FIC 指数は前述のように決定されました 30。 式 (1) および (2) を使用して、セフォキシチンまたは各生理活性物質の FIC 値を決定しました。 (3) を使用して FIC インデックスを計算し、2 つのコンポーネントの組み合わせ効果を決定します。

ここで、FICA と FICB はそれぞれ薬剤 A と薬剤 B の FIC 値です。 MICA および MICB は、それぞれ薬剤 A および薬剤 B 単独の MIC です。 MICC は、薬剤 A と薬剤 B を組み合わせた MIC です。 FIC 指数 (FICi) は、FICA と FICB の合計です。

以下の生理学的アッセイおよび qPCR アッセイでは、それぞれの MRSA 株を次のように増殖させました。 各 MRSA 株を 10 mL のカチオン調整ミュラー ヒントン培地 (「未処理」) および 30 mg/mL のプロバイオティクス生物活性物質を補充した 10 mL のカチオン調整ミュラー ヒントン培地 (「処理」) に植菌し、37 ± でインキュベートしました。特に明記しない限り、1 °C および 200 rpm で 24 時間振盪します。

サンプルは上記のように調製した。 インキュベーション後、以前に確立されたメタノール抽出プロトコル 23 を使用してブドウ球菌カロテノイドを抽出しました。 抽出されたカロテノイドを含む上清を標準 96 ウェル プレートに 200 μL (重複して) ピペットで移し、波長 450 nm (A450) での吸光度を SpectraMax M2 マイクロプレート リーダー (Molecular Devices、サンノゼ、米国) で測定しました。 ）。

サンプルは上記のように調製した。 インキュベーション後、サンプルを 4000 rpm で 15 分間遠心分離し、1 × ダルベッコ PBS 溶液 (VWR Life Science、ラドナー、米国) で洗浄し、1.5% v/v 過酸化水素溶液に約 109 ～ 1010 CFU/mL で再懸濁しました。 次に、以前に確立されたプロトコールに従って、酸化剤感受性アッセイを実施しました23。

サンプルは記載どおりに調製されました。 サンプルの段階希釈を実行し、100 μL の希釈サンプルを 5% v/v 滅菌脱線維素羊血を補充した TSA プレート (Cedarlane、バーリントン、オンタリオ州、カナダ) に二重に播種しました。 プレートを 37 ± 1 °C で 15 ～ 20 時間インキュベートし、溶血と CFU/mL カウントを分析しました。

サンプルは上記のように調製し、MRSA 414M サンプルの場合は 4 時間および 6 時間、MRSA 81M サンプルの場合は 5 時間および 6 時間、37 ± 1 °C、200 rpm で振とうしながらインキュベートしました。 サンプルの RNA 抽出は、illustra™ RNAspin キット (GE Healthcare、バッキンガムシャー、英国) に従って実行されました。 逆転写およびcDNA合成は、High Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(Applied Biosystems、Foster City、USA)に従って実施した。 qPCR 実験は CFX96™ リアルタイム システム C1000™ サーマル サイクラーを使用して実行され、データ分析は付属の CFX Manager 3.1 ソフトウェア システム (Bio-Rad、Hercules、USA) を使用して実行されました。 選択された遺伝子とそのプライマーペアは補足表S1にリストされています。

サンプルを上記のように調製し、414M サンプルと 81M サンプルの両方について、37 ± 1 °C、200 rpm で振盪しながら 4 時間、6 時間、および 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、サンプルをクリスタルバイオレットで染色し、光学顕微鏡用に準備し、iPad Pro (ECHO Inc.、サンディエゴ、米国) を備えた Upright Revolve 4 Microscope を使用して観察しました。 SEM サンプルは前述のように準備されました 44。 サンプルは両面テープを使用してスタブに取り付けられ、Denton 真空システムを使用して金でスパッタ コーティングされ、15 kV で動作する Hitachi TM3000 走査型電子顕微鏡 (日立ハイテクノロジーズ株式会社、東京、日本) で観察されました。

MICデータは、二元配置ANOVAに続いて、GraphPad Prismバージョン9(GraphPadソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用するダネットの多重比較検定によって分析した。 すべての qPCR データは、CFX Manager 3.1 ソフトウェア システム (Bio-Rad、Hercules、USA) を使用した ANOVA によって分析されました。 カロテノイド吸収アッセイおよび SCV 細胞数パーセントのデータは、Microsoft Excel を使用した Mann-Whitney U 統計検定によって分析されました。 過酸化水素による細胞死滅データは、Microsoft Excel を使用した一対の統計検定の Wilcoxon 符号付きランクによって分析されました。 記載されているすべての複製 (n) は、技術的複製の平均生物学的値です。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、臨床MRSA株を提供してくれたカナダのPE、シャーロットタウンにあるAtlantic Veterinary CollegeのJ Trenton McClure博士と、株の調達を促進してくれたMatthew Saab氏に感謝したい。 著者らは、実験計画と実施に関して協力してくれた Jonathon Roepke に感謝したいと思います。 著者らはまた、Enterococcus faecium株を提供していただいたカナダのオンタリオ州グエルフにあるカナダ食品安全研究所にも感謝したいと思います。 最後に、この研究は技術開発のための産業研究支援プログラムを通じてカナダ国立研究評議会によって部分的に支援されました。

機械工学科、エコール・ド・テクノロジー・シュペリウール（ÉTS）、モントリオール、QC、H3C 1K3、カナダ

モニカ・アンジェラ・セラ、サラ・バドル、アリ・アフマディ

MicroSintesis Inc.、ビクトリア、PE、COA 2G0、カナダ

トーマス・コールソン、サマンサ・マクイーチャーン、マフディス・サダット・タバタベイ、アラン・ラベ

カナダ食品安全研究所、グエルフ大学、オンタリオ州グエルフ、N1G 2W1、カナダ

マンセル・ウィリアム・グリフィス

グエルフ大学食品科学部、グエルフ、オンタリオ州、N1G 2W1、カナダ

マンセル・ウィリアム・グリフィス

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MAC は細胞毒性アッセイとカロテノイド測定を実施しました。 MAC と SM は MIC テストを実施しました。 MST は SEC 分別を実行しました。 MAC、TC、AL、および MWG は、データ分析とアッセイ結果に関する洞察を提供しました。 SB と AA はイメージングを実行し、顕微鏡画像を分析しました。 MAC と TC は原稿を書き、図を作成しました。

Thomas Coulson または Alain Labbe への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

マサチューセッツ州セラ、T.コールソン、S.マックイーチャーンら。 プロバイオティクスによるクオラムセンシングの破壊は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の病原性を低下させ、セフォキシチン感受性を増加させます。 Sci Rep 13、4373 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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受信日: 2022 年 11 月 9 日

受理日: 2023 年 3 月 13 日

公開日: 2023 年 3 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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