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May 21, 2023

脾臓から判明したマラリア伝播を阻止する可能性が高い安全な薬剤

Nature Communications volume 14、記事番号: 1951 (2023) この記事を引用

1496 アクセス

9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

熱帯熱マラリア原虫のようなマラリア原虫は赤血球 (RBC) 内で増殖しますが、その変形性が変化すると脾臓によって血流から除去されます。 したがって、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球の薬剤誘発性硬化は、血流からのそれらの除去を誘導するはずである。 ここでは、この独自の機械的アプローチに基づいて、マラリアの伝播を阻止する強力な可能性を持つ安全な薬剤を特定します。 脾臓模倣マイクロフィルターを使用して 13,555 の化合物をスクリーニングすることにより、循環伝染性型の熱帯熱マラリア原虫を標的とする 82 の化合物を特定しました。 NITD609は、熱帯熱マラリア原虫に対する既知の効果を有する経口投与型PfATPase阻害剤であり、ナノモル濃度でインビトロで感染段階を死滅させ、強化した。 経口投与される NS5A C 型肝炎ウイルス阻害剤である TD-6450 への短時間曝露は、高ナノモル濃度で in vitro で感染寄生虫段階を強化し、無性段階を死滅させます。 一次安全性アウトカムと二次薬物動態アウトカムを対象としたヒトを対象とした第 1 相試験 (https://clinicaltrials.gov、ID: NCT02022306) では、単回投与でも複数回投与でも重篤な有害事象は示されませんでした。 薬物動態モデリングにより、TD-6450の短期コースを受けた被験者の血漿中でこれらの濃度に到達できることが示されました。 この生理学的に関連したスクリーニングにより、複数の作用機序と、臨床試験で迅速に試験できるマラリア感染阻止剤としての強力な可能性を備えた安全な薬剤が特定されました。

2000 年から 2015 年の間に、マラリアの発生率と死亡率はそれぞれ 27% と 50% 減少しました。 発生率の減少は2015年から2019年の間に止まり、2020年には発生率と死亡率の両方が憂慮すべき再増加さえ見られました。 マラリア関連の感染者数は2億4,100万人、死者数は62万7,000人です1。 東南アジア2,3,4、そして最近ではアフリカ5,6におけるアルテミシニン耐性熱帯熱マラリア原虫株の出現により、この病気の制御はさらに脅かされています。 したがって、ヒト宿主から媒介蚊への熱帯熱マラリア原虫の伝播を阻止することにより、マラリアの発生率が減少し、できれば世界的な根絶に貢献できると考えられています7。 マラリア原虫の成熟した性的段階であるステージ V 生殖母細胞は、ハマダラカ種媒介動物に伝播される唯一の形態であり、その数が少ないため、寄生虫のライフサイクルに自然なボトルネックが生じ、寄生虫の伝播を阻止する格好の標的となります 8。

脾臓は硬い赤血球を保持し、循環から赤血球を除去します9,10。 1 個の赤血球は、脾臓洞の壁にある狭い内皮間スリットを通って絞り出されるまで、循環内で 2 時間も経過しません 11、12。 マラリアでは、最も変形しやすい段階、つまり輪(未熟無性段階)と段階 V 生殖母細胞のみがこの機械的課題を克服し、循環中に存続することができます 8、13、14、15、16。 硬い未熟生殖母細胞から変形可能な成熟生殖母細胞への切り替えは、ステージ IV と V13,16 の間の 10 ~ 12 日間の成熟プロセスの終わりに起こります。 したがって、ステージ V の生殖母細胞の薬物誘発性硬化により、生殖母細胞は伝達サイクルから除外されるはずです。 寄生虫を死滅または不活化できる生殖母細胞を標的とした化合物を同定するためのいくつかのスクリーニングアプローチが研究されている17、18、19、20、21、22。 これらのアプローチにより、可変の創薬可能性を示す興味深い候補ターゲットが特定されました。 最近、再利用に適した薬物の大規模なライブラリが利用可能になりました 23。 これにより、効果的かつ迅速に展開可能な送信阻止の候補を特定する機会が得られます24。 寄生虫の標的を見つけることを目的として、我々は寄生赤血球に対する硬化活性について数千の化合物をスクリーニングする生理学的に適切なアプローチを確立しました。

私たちのアプローチでは、顕微濾過と呼ばれる脾臓模倣濾過法を使用し、赤血球がミクロスフェア間を圧迫する能力を定量化します25。 この方法は薬物スクリーニング 26,27,28 に適用され、その後、活性ミトコンドリア染色に基づく寄生虫死滅の評価と組み合わされています 19。 今回の研究では、この生体模倣アプローチを使用して、再目的ライブラリーから 12,000 を超える化合物を、ヒト脾臓における成熟熱帯熱マラリア原虫配偶子母細胞の保持を誘導する能力についてスクリーニングしました。

スクリーニングは前述のように実施されました27。 簡単に説明すると、成熟ステージ V 配偶母細胞 (NF54 株) を in vitro で培養し、探索した化合物に曝露し、その後ミクロスフェアの層を通して濾過しました (顕微濾過) 25,28。 硬化活性は、真空マニホールドを使用して 384 ウェル プレート内の薬物に曝露された配偶子母細胞を濾過した後、ミクロスフェア層の上流と下流の配偶子血症を比較することによって決定されました。 配偶子血症は、DNA (Sybr Green) および赤血球膜 (CellMask) 染色を使用して評価されました。 殺傷効果は MitoTracker 染色によって評価されました 19。 私たちは 2 つの小さなライブラリ、特に Medicine for Malaria Venture の Pathogen Box と GSK の Kinase Inhibitors Box (それぞれ 400 と 350 の化合物、図 1A、B) をスクリーニングし、さらに大規模な ReFrame 再利用ライブラリ (12,805 化合物、図 1B) をスクリーニングしました。 .1C)。

3 つの異なるライブラリーのスクリーニング進行カスケード: マラリア病原体ボックス (A)、キナーゼ阻害剤ボックス (B)、および ReFrame ライブラリー (C)。 一次スクリーニングからの 3 つのヒットは、すべてではないが一部のスクリーニング反復で活性が見出された 12 化合物とともに用量反応分析に提出されました。 3 件のヒットが確認されましたが、いずれもスクリーニング後のさらなる検証には選択されませんでした。 B 一次スクリーニングからの 4 つのヒットと、すべてではないが一部のスクリーニング反復で活性が見出された 5 つの化合物を用量反応分析に提出し、3 つの確認されたヒットが得られました。 それらのいずれも、さらなるスクリーニング後の検証には選ばれませんでした。 一次スクリーニングからの C 112 件のヒットが用量反応分析に提出され、74 件の確認されたヒットが得られました。 一次スクリーニング中に解釈不能な結果が得られた 63 化合物が用量反応分析のヒットに追加され、さらに 2 つの確定ヒットが得られました。 確認された 76 のヒットは、その活性と分子標的に基づいて 7 つのグループに割り当てられました (右側のパネル)。 各グループの代表的なヒット曲を 1 つ選んで説明します。 投与経路、ヒト被験者における安全性、および薬物動態に基づいたヒットスコアリングにより、最終確認実験に提出された 3 つの薬剤が選択されました (濃い青色)。

小さなライブラリー (キナーゼ阻害剤および病原体ボックス) について、一次スクリーニングを 6 回または 3 回繰り返しました。 スクリーニング結果プロット上の化合物分布の線形回帰に基づいて、プレートごとにヒットを選択しました (図 2C、D)。 病原体ボックスとキナーゼ阻害剤ボックスでそれぞれ 3 件と 4 件のヒットが見つかりました (図 1A、B)。 それぞれのヒット率は 0.75% と 1.14% でした。 すべてではないが一部のスクリーニング反復で活性のある化合物を、さらなる分析のためにヒットに追加しました。 より大きな ReFrame ライブラリーを 1 回ずつスクリーニングしたところ、112 件のヒットが得られました (ヒット率 0.87%、図 1C)。 検出されたヒットには、主な硬化活性 (44%)、主な殺傷効果 (28%)、またはその両方の組み合わせ (28%、図 2A、B) がありました。 Z' 値は 0.4 から 0.7 の間でした (図 S1)。 これら 112 件のヒットと、一次スクリーニングで解釈できない結果が得られた 63 件の化合物 (0.6%) をさらに調査しました。

代表的なスクリーニング出力の散布図は、特定の (A) および ReFrame (B) ライブラリーと、最終的に選択されたヒットとして NITD609 (C) および TD-6450 (D) を含む、ReFrame の一次スクリーニングからの 2 つの単一プレートの散布図です。 パネル A では、「K」はキナーゼ阻害剤ボックスを指し、「P」は病原体ボックスを指します。 殺害率と保持率はそれぞれ x 軸と y 軸にあります。 ネガティブコントロール(赤い四角)、および硬化活性のカリクリンA 75 nM(緑の三角)、殺傷効果のリンドウバイオレット50 μM(緑の丸)、および硬化と殺傷効果の組み合わせ(緑の四角)のNITD609 0.5 μMを含むポジティブコントロールは低下しました。線形回帰 +/-95% 予測バンド SD (それぞれ実線と点線) によって定義される不活性な試験化合物の主な雲 (空の灰色の円) の内側と外側。 ヒットは DRA によって確認された (青い X) か、確認されなかった (青い空の三角形) かのいずれかです。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

用量反応分析 (DRA) 用に 119 件のヒットが選択されました。そのうち 3 件は Pathogen Box から、4 件は Kinase Inhibitors Box から、112 件は ReFrame ライブラリーからでした。 硬化効果、殺傷効果、またはその両方の共存の確認が、ヒットのさらなる分析の基準でした。 殺傷効果と硬化活性の両方について IC50 値が得られましたが (図 3、表 S1)、さらなるヒットの優先順位付けには IC50 カットオフ値は使用されませんでした。 IC50 を決定できない場合、ヒットの優先順位は低くされました。 病原体およびキナーゼ阻害剤ボックスからの 7 つのヒットのうち 6 つが確認されました (確認率 86%、図 1A、B)。 すべてではないが一部のスクリーニング反復で効果を示したさらに 17 の化合物 (病原体ボックスから 12 個、キナーゼ阻害剤ボックスから 5 個) も DRA 用に選択されました。 いずれも活動中であることは確認されなかった。

選択した 3 つのヒットの用量反応曲線と化学構造: NITD609 (A)、TD-6450 (B)、および L-THP (C)。 TD-6450 は純粋なエナンチオマーでした。 立体中心は次のとおりです: (S)−1-((S)−2-(5-(4'-(6-((2 R,5 S)。データは平均値 +/- SEM として表示されます。NITD609 および L の場合) -THP、n = 2 の独立した実験、TD-6450 の場合、n = 4 つの独立した実験 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Pathogen Box からの 3 つの DRA 確認済みヒット、すなわち MMV020081、MMV667494 および MMV030734 は、このライブラリーの以前の生殖母細胞を標的としたスクリーニングで同定されていました 29、30、31。 それらのうちの2つ、MMV667494およびMMV030734は、雌の配偶子形成に特異的な高い殺傷活性を示しました(表S2)。 MMV667494 および MMV030734 は、死滅を誘導する濃度よりも低い濃度で生殖母細胞の硬化を誘導しました。 キナーゼ阻害剤ボックスから確認されたすべてのヒットには、同じ化学足場がありました (表 S2)。 一次スクリーニングでテストされていない 1 つの化学類似体がこのリストに追加され、DRA でテストされました。 この化合物は、最も強力なヒットの IC50 値に近い IC50 値 (殺傷および保持についてそれぞれ 2.44 および 0.8 μM、表 S2) を示し、さらなるスクリーニング後の検証に使用されました。 ReFrame ライブラリからの確認されたヒットは、主な硬化活性 (ヒットの 40%)、主な殺傷効果 (30%)、または両方の組み合わせ (30%) のいずれかを持っていました (表 S1)。

ReFrame ライブラリからの 112 件のヒットのうち、74 件が DRA によって確認されました (確認率 66%、図 1C)。 一次スクリーニングで解釈できない結果が得られた追加の 63 化合物も DRA 用に選択されました。 これら 63 種類の化合物のうち 15 種類については、384 ウェル顕微濾過プレートの対応するウェルがミクロスフェアの漏出により動作しませんでしたが、これはまれな出来事です 27。 46 の化合物について、顕微鏡は少なくとも 1 つの読み取り可能な画像をキャプチャできませんでした。 最後に、DRA によってシルデナフィルとタダラフィルをテストしました。 これら 2 つの薬剤は一次スクリーニングでは捕捉されませんでしたが、ステージ V の生殖母細胞の硬化を誘導することが以前に報告されています 32,33。 IC50 値は、殺傷効果と硬化活性の両方、または場合によってはそれらの一方について得られました (図 3、表 S1)。 これら 63 化合物の中で 2 つの確認されたヒットが見つかりました。これは、スクリーニング キャンペーン全体のヒット率 (0.87%) と一致しています。 これら 2 つのヒットは、L-テトラヒドロパルマチン (L-THP) と亜鉛ピリチオンでした。

構造、標的、および病原体ボックスおよびキナーゼ阻害剤ボックスから確認されたヒットに関する以前のスクリーニングアプローチの結果を表S2に示します。 ReFrame ライブラリからのヒットは、ヒト被験者の既知の分子標的または医学的適応に基づいて 7 つのグループに分類されました (図 1 および表 S1)。 ナトリウム-カリウムATPアーゼポンプを標的とする強心配糖体(7ヒット)。 キナーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (6 件のヒット); 既知のマラリア伝播阻止候補メチレンブルー(2 ヒット)のようなモノアミンオキシダーゼ(MAO)阻害剤 34 も、以前の生殖母細胞スクリーニングキャンペーン 35,36 で選択されました。 抗マラリア薬 (6 ヒット)。 抗生物質/抗ウイルス剤 (18 ヒット) と、定義されたグループに割り当てられない化合物の最後のグループ (28 ヒット)。 ヒト細胞、細菌、ウイルス、または寄生虫におけるヒットの既知の分子標的をリストしました(表S1)。 熱帯熱マラリア原虫における相同性の分析により、まだ特徴付けられていない生殖母細胞の死滅および/または硬化の経路が特定される可能性があります。

ReFrame ライブラリからのヒットは、安全性、できれば経口投与 (経口の場合は高スコア)、および広範囲に使用できる可能性を考慮してさらに選択されました。 簡単に言うと、動物モデルまたはヒト被験者に経口投与されなかった選択されたヒットが除外されました(76 のうち 44 の確認されたヒットが除外されました)。 そして、残りの32本がセーフティとPKにランク付けされた。 感染防止はほぼ完全な安全性を課すため、重篤な有害事象を示した薬剤は除外されました。 最後に、最良の治療域(IC50 より大きい、または IC50 に近い血清ピーク)を持つヒットをさらに調査しました。 例えば、優れた安全性プロファイルを持つ抗マラリア薬である MMV-390048 は、治療範囲が存在しないか非常に狭いため、さらなる分析から除外されました (IC50 3.5 ~ 3.9 μM、血清ピーク濃度 2.8 μM37)。 この選択によると、最も魅力的な 3 つの薬剤は、NITD609、L-THP、および TD-6450 でした (表 1)。 シパルガミンとしても知られる NITD609 は、熱帯熱マラリア原虫 ATPase 4 の強力な阻害剤です。無性寄生虫と性的寄生虫の両方の段階でナノモル濃度で強力な殺傷効果を示し 38,39、無性寄生虫に対して硬化活性を示します 40。 NITD609 は現在、アフリカの大規模な複数施設での第 2 相試験で試験中です。 今回の結果は、生殖母細胞に対する既知の効果を確認しました41が、さらに、成熟生殖母細胞に対するその硬化活性を明らかにしました(図2Cおよび3A)。これは、治療時に循環中に存在する伝染性形態の非常に迅速なクリアランスを誘導すると予想されます。 L-THP は、抗不安作用と鎮静作用をもつアルカロイドであり、現在、精神疾患や依存性行動を対象として開発中です42。 しかし、それはまた、熱帯熱マラリア原虫の無性期にも影響を与えることが知られています43。 現在の分析により、その抗マラリア効果のスペクトルは寄生虫の性的段階まで拡張されました(図3C)。 TD-6450 は、C 型肝炎ウイルス感染症の治療のために開発された NS5A 阻害剤です。 優れた安全性 (表 2) およびこの薬剤ファミリーの他のメンバーと同様の抗 HCV 有効性が確実に示されているにもかかわらず、C 型肝炎の治療法としての TD-6450 の開発は、戦略的理由により第 2 相以降中止されました。 L-THP は、無性期での活性が知られているにもかかわらず 43、スクリーニング後の硬化活性が完全には確認されなかったため、それ以上研究されませんでした。 TD-6450 と NITD609 は、本研究でのさらなる調査のために保持されました。

TD-6450 および 2 つの対照化合物、すなわち NITD609 および GSK1321730A の硬化活性は、スクリーニング中に使用したもの (NF54) 以外の寄生虫株 (3D7) を用いた DRA によって確認されました。 この確認は、異なるマイクロプレート形式 (パリでは 96 ウェル、マドリッドでは 384 ウェル) を使用して、異なる研究室 (パリ対マドリッド) で実施されました。 TD-6450 の IC50 中央値 (±SD) はマイクロモル未満の範囲でした (0.28 ± 0.58 μM、5 回の独立した実験)。 正規化された保持率は、NITD609 (66%、p < 0.0001) と TD-6450 (27%、p < 0.0001、図 4B) の両方で有意な効果を示し、TD-6450 と比較して NITD609 の硬化活性が高かった。 NITD609 と TD-6450 を組み合わせると、いずれかの薬剤を単独で使用した場合と比較して、生殖母細胞の硬化が有意に増強されました。つまり、NITD609 では 73% 対 66% (p = 0.0058)、TD-6450 では 27% (p < 0.0001) (図 4B)。 薬剤誘発性硬化の持続性も分析されました。 生殖母細胞を薬物に24時間曝露して培養し、薬物洗い流し後さらに24時間後に顕微濾過により保持を再測定した(図4C)。 この設定では、TD-6450 は NITD609 よりも優れた持続性硬化活性を示しました (43% 対 23%、p = 0.0525) (図 4C)。 顕微鏡観察により、NITD609 によって媒介される既知の寄生虫の膨張効果が確認されましたが、TD-645044 に曝露された配偶子細胞では形態学的変化は観察されませんでした。 この観察は、フローサイトメトリーのイメージングによって得られたアスペクト比値によって確認されました (図 4A)。 スクリーニングキャンペーン(マドリッド)中のTD-6450のIC50は、すべての生殖母細胞または雌のみが染色された場合(2回の実験)、それぞれ455±304nMまたは2.03±0.35μMでした。 これらの読み出し依存性の違いは、いくつかの抗生殖母細胞化合物で以前に観察されたように、TD-6450 が雄の生殖母細胞に対して主に活性であることを示唆しており、おそらくこの薬剤による明らかな部分的な効果を説明していると考えられます。

DMSO (陰性対照、緑枠)、TD-6450 5 μM (青枠)、および NITD609 1 μM (赤枠) に 24 時間曝露した熱帯熱マラリア原虫の成熟生殖母細胞に感染したギムザ染色赤血球。 イメージングフローサイトメトリーによる生殖母細胞の円形度をアスペクト比を測定して比較したところ、DMSOとNITD609の間で有意な差が示されました。 実験は 1 回実行されました。 B ステージ V の熱帯熱マラリア原虫の生殖母細胞 (3D7 pULG8-GFP 株) を TD-6450 (青)、NITD609 (赤)、または両方の組み合わせ (紫) に 24 時間曝露した 5 回の顕微濾過実験の累積ドットプロット。 C 生殖母細胞を薬物に 24 時間曝露し、薬物除去後さらに 24 時間培養状態に保った 4 回の顕微濾過実験の累積ドットプロット。 ドットは、96 ウェル顕微濾過プレートの単一ウェルの保持率を示します。 B、C では、培養生殖母細胞集団がカラム全体を満たせるほど大きくない場合を除き、各実験は 1 回の生殖母細胞誘導で実行され、各条件の 1 つの 8 ウェル カラムにロードされました。 反復回数は左から右に、40 (各実験につき 8 回)、40 (各実験につき 8 回)、32 (4 つの実験につきそれぞれ 8 回)、32 (4 つの実験につきそれぞれ 8 回) です。 箱ひげ図は中央値と IQR を示します。 DMSO(緑色)への曝露はネガティブコントロールでした。 一元配置分散分析検定後の P 値と F 値は、それぞれ 0.0001 未満で 110 (B)、0.0005 と 6.365 (C) でした。 個々の p 値の凡例: *p = 0.05 ~ 0.01、**p = 0.01 ~ 0.001、***p = 0.001 ~ 0.0001、****p < 0.0001。 0.0001 より大きい場合の個々の p 値は次のとおりです: パネル B、NITD609 対組み合わせ、0.0058。 パネル C、DMSO 対 NITD609、0.0096。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

無性寄生虫に対する TD-6450 の有効性に関して、IC50 は 3D7 で 875 ± 205 nM、NF54 株で 1.33 ± 0.23 μM でした (2 回の実験、図 5B)。 ギムザ染色塗抹標本を顕微鏡で観察すると、NITD609 に曝露された輪の膨潤が確認されましたが、TD-6450 に曝露された無性輪は膨潤せずに成熟の遅延と濃縮を示しました(図 5A および図 S2)。これは、これらの薬物が異なるメカニズムで作用することを示唆しています。 TD-6450 に対する耐性を発現する熱帯熱マラリア原虫の能力を評価するために、参照アルテミシニン感受性熱帯熱マラリア原虫株 45 である F32-TEM 系統寄生虫を 3 μM 濃度の薬剤に 3 日間曝露しました。 暴露後のギムザ染色塗抹標本に寄生虫が存在しないことを確認し、薬物を含まない培養フラスコで寄生虫の再出現を毎日チェックしました。 このような薬物殺傷パルスを 5 回または 10 回照射した寄生虫 45 では、TD-6450 の IC50 がそれぞれ 3.5 倍および 1.5 倍変化することが観察されました (図 5C)。最後のパルス。 この低レベルの IC50 シフトは、in vitro で TD-6450 に対して顕著に耐性のある寄生虫の急速な出現がないことを示唆しています。

DMSO (陰性対照、緑の枠)、TD-6450 5 μM (青の枠)、および NITD609 1 μM (赤の枠) に曝露された熱帯熱マラリア原虫のリング段階に感染したギムザ染色された赤血球。 光学顕微鏡観察は5回繰り返した。 B TD-6450 (青) および NITD609 (赤) に 48 時間曝露した、同期環期熱帯熱マラリア原虫 (NF54 および 3D7 pULG8-GFP 株) の用量反応。 C TD-6450による薬物パルスの5回(青)または10回(水色)の前(濃い青)、または後のF32-TEM株の用量反応。 各点は、3 回の反復の平均 (±SD) を示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

TD-6450 は、C 型肝炎ウイルス感染症の治療のために Theravance Biopharma Inc によって発見および開発されましたが、戦略上の理由から第 II 相以降に中止されました。 最初の第 I 相臨床試験は 2014 年に完了しました (臨床試験 ID: NCT02022306)。 この研究の主な目的は、健康な被験者における単回漸増用量 (SAD) および複数漸増用量 (MAD) の安全性と忍容性を評価することでした (表 2)。 第 2 の目的は、SAD と MAD の両方について、健常者における TD-6450 の薬物動態 (PK) を測定することでした。 この第 1 相研究から得られた PK データを使用して、濃度と時間のモデリングを作成しました。 健康なボランティアで実施された単回漸増用量(SAD)および複数漸増用量(MAD)研究からのデータでは、適合度は高かった(図6A)(図6B、C)。 次の追加の共変量関係は、最終モデルでも保持されました: 相対バイオアベイラビリティに対する用量。ホッケースティック関数として実装され、240 mg から 500 mg の用量で相対バイオアベイラビリティが直線的に減少します (つまり、投与量 100 mg 増加あたり 24.7% 減少)。用量、240mg以上); 除去クリアランス時の用量は、より高い用量で完全な飽和に達する飽和関数として実装されます。 定常状態の投与で完全飽和に達する飽和関数として実装される相対バイオアベイラビリティに関する治療期間。 相対的なバイオアベイラビリティに対する食物摂取。カテゴリ共変量効果として実装されます(つまり、食物と一緒に投与するとバイオアベイラビリティが 68.5% 高くなります)。 および吸収率に対する食物摂取は、カテゴリ共変量効果として実装されました(つまり、食物と一緒に投与すると吸収時間が93.3%長くなります)(表3)。

最終的な薬物動態モデルの適合度 (A)。 シミュレーションベース (n = 2000 の独立したシミュレーション) 診断 (pvcVPC)。最終的な PK モデルの予測パフォーマンスを、単回投与 (B) と複数回投与 (C) で階層化して表示します。 モデリングを実現するために使用された PK データは、Theravance Biopharma によって利用可能になりました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

モデリング出力に基づいて、食物なし(図7A)および食物あり(図7B)の1000 mgの単回用量の濃度-時間シミュレーション(図S3)が生成されました。 このモデルによれば、8時間の曝露後に成熟生殖母細胞を著しく硬化させる200 nMの血漿濃度(図7C)は、単回投与で集団の90%および100%において少なくとも8時間維持される。 1000mgを食事なしまたは食事と一緒に投与します。 この濃度 (200 nM) は、集団全体の適用範囲 (すべてのモデリング共変量を含む) と、顕著な in vivo クリアランスに変換されると予想される TD-6450 の in vitro 硬化活性との間の最良の妥協点です。

健康なボランティアを対象に、絶食状態 (A) および食事とともに投与 (B) したときの TD-6450 の単回経口投与量のシミュレーションによる集団薬物動態プロファイル。 黒の実線は母集団平均プロファイルで、灰色の影付き領域は 90% の予測区間を示します。 赤い破線は、成熟生殖母細胞の顕著な硬化に関連する 200 nM の濃度を示します。 モデリングを実現するために使用された PK データは、Theravance Biopharma によって利用可能になりました。 C 生殖母細胞を薬剤に8時間曝露し、10倍に希釈し、24時間後に濾過した3回の顕微濾過実験の累積ドットプロット。 ドットは、96 ウェル顕微濾過プレートの単一ウェルの保持率を示します。 培養生殖母細胞集団がカラム全体を満たすのに十分な大きさでない限り、各実験は単一の生殖母細胞誘導で実行され、各条件に対して単一の 8 ウェル カラムにロードされました。 繰り返し回数は左から右へ: 23 (最初の 2 つの実験で 8 回、3 番目の実験で 7 回)、16 (最初の 2 つの実験でそれぞれ 8 回)、23 (最初の 2 つの実験で 8 回、3 番目の実験で 7 回) )、7 (3 回目の実験のみ)、7 (3 回目の実験のみ)。 箱ひげ図は中央値と IQR を示します。 DMSO(緑色)への曝露はネガティブコントロールでした。 一元配置分散分析検定後の P 値と F 値は、それぞれ 0.0001 未満と 12.09 に等しくなりました。 個々の p 値の凡例: *p = 0.05 ~ 0.01、**p = 0.01 ~ 0.001、***p = 0.001 ~ 0.0001、****p < 0.0001。 0.0001 より高い場合の個々の p 値は次のとおりです: DMSO 対 TD-6450 200 nM、0.0284。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ハイスループットスクリーニングに適応した脾臓模倣アプローチを使用して、最も重篤かつ致死的なマラリア発作の原因となる熱帯熱マラリア原虫の伝播段階を強化または死滅させる82の化合物または薬物を同定した。 同定された活性薬剤のうち 3 つは人体に安全に使用でき、経口投与されます。 そのうちの 2 つ、NITD609 と TD-6450 を組み合わせると、脾臓模倣フィルターにおける熱帯熱マラリア原虫生殖母細胞の高い保持率が誘導されます。 脾臓の滞留により、血液からの赤血球の除去が起こります10、12、46。 したがって、硬化活性を提供する薬剤は、吸血するハマダラカ蚊媒介体が伝播可能な形態を利用できないようにすることで、マラリアの伝播を阻止することができます9,10。 生殖母細胞段階は、蚊への感染に向けた寄生虫サイクルの狭いボトルネックです8。 その伝播を阻止することはすでにマラリア撲滅活動の主要な要素となっており7、最近の殺虫剤耐性蚊47、アルテミシニン耐性寄生虫6の出現、そして最近の世界的なマラリア発生率の上昇1に対処することはさらに重要になる可能性がある。 私たちの成功したアプローチにより、抗生殖母細胞化合物のリストが充実しました。 私たちは、殺傷に基づくアプローチでは捕捉されなかった化合物、標的、そしておそらくは抗生殖母細胞薬を特定しました。 NITD609 および TD-6450 の優れた安全性プロファイルと、それらの生殖母細胞クリアランス効果の生理学的関連性の両方から、この適応症におけるヒトにおける迅速な評価が求められています。 脾臓模倣赤血球濾過は、生体外で灌流されたヒト脾臓に対して検証されているため 48、NITD609 および TD-6450 は、実際にヒト被験者の循環中の生殖母細胞濃度を低下させることが期待されます。

これまで、成熟生殖母細胞の機械的特性は小規模でしか研究されておらず 13,16 、ミクロスフェアの層を通した赤血球の濾過(「顕微濾過」) 25 を生殖母細胞の補強材のハイスループットスクリーニングに適応させることは技術的な課題でした。 ただし、顕微濾過では数百 28 から数千のサンプル 27 を同時に分析できるため、この努力には価値があります。 大規模な生殖母細胞の生産、384 ウェル プレートでの顕微濾過、およびハイコンテンツ イメージングの合理化された組み合わせにより、最終的に堅牢なアッセイが実現されました。スクリーニング キャンペーンでは、メチレン ブルー、Pf-ATPase 4 阻害剤、および Pf-PI4K 阻害剤を分析し、ヒット選択プロセスの正確性を確認します。 実際、以前のスクリーニングキャンペーンでは、メチレンブルー 31,33,34 と、ATPase 4 (NITD609 および PA92)、EF2 (DDD49849)、PI4K の阻害剤 (MMV390048)50 がマラリア伝播阻止候補として同定されていました。 いくつかのグループがすでにPathogen Boxライブラリーをスクリーニングしており29、30、31、我々の研究により3つの薬剤、すなわちMMV020081、MMV667494およびMMV030734の効果が確認された。 私たちの研究では、後者の2つは特に女性の生殖母細胞を硬化させ、抗生殖母細胞化合物の性別に偏った効果が頻繁に発生することが確認されました18。 われわれは、がんを対象として臨床開発中の9種類のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC)のクラスターと、症候性マラリア51を含む他の疾患の有望な候補物質を同定し、HDAC経路がマラリア伝播に関与しているというさらなる証拠を提供した52。 しかし、我々はこの化合物群についてはこれ以上調査しませんでした。なぜなら、それらの安全性を徹底的に分析した結果、癌または潜在的に重度の症候性マラリアの治療には許容されるが、おそらくマラリア感染阻止介入には許容できないことが判明したからです53,54。 将来の最適化により、熱帯熱マラリア原虫に対してより選択的で、より優れた安全性プロファイルを備えた HDAC 阻害剤が特定される可能性があります 55。 重要なのは、いくつかの潜在的な薬物メカニズムまたは分子標的も発見したことです。 ヒットした化合物の中には、硬化作用のみを持つ 9 種類の化合物があり、具体的には、ATPase ポンプを標的とする 7 種類のヒト強心配糖体と、ATP シンターゼの阻害を通じて酸化的リン酸化に影響を与える抗生物質であるオリゴマイシン A および B でした。 私たちの発見は、生殖母細胞の生体力学に関与する新しい分子経路を明らかにする可能性があります。 特に、グラミシジンは細菌膜に漏出を引き起こす孔形成性抗生物質であり、IC50 が低いナノモル範囲にある最も強力な生殖母細胞キラーでした。

私たちは、NITD609 と TD-6450 という 2 つの薬剤の感染阻止の可能性について、スクリーニング後の調査に焦点を当てました。 NITD609 (シパルガミンとしても知られる) は、すべての段階の熱帯熱マラリア原虫に対して活性を持つ ATPase 4 阻害剤です。 別の ATPase 4 阻害剤である PA92 もスクリーニング キャンペーンで捕捉され、これらの阻害剤が感染阻止戦略の有望な標的であることが確認されました 54。 非構造タンパク質 5A (NS5A) 阻害剤である TD-6450 は、C 型肝炎治療のための第 II 相臨床試験で試験されています。成熟生殖母細胞の硬化を介したその抗マラリア効果は、我々のスクリーニング キャンペーンによって明らかになりました。 TD-6450 がマイクロモル範囲の濃度で寄生虫の増殖を阻害するということは、その作用が未感染の RBC に対する推定効果に基づくものではなく、主に寄生虫特異的であることを示唆しています。 実際、未感染の RBC は、in vitro での TD6450 または NITD609 への曝露による影響を受けませんでした (または軽度にしか影響を受けませんでした) (図 S5)。 一般に非構造タンパク質 5A 阻害剤、特に TD-6450 は経口的にヒト被験者に安全に投与されます (表 S3)55、56、57。 TD-6450 と高い相同性を示す薬剤であるレディパスビルは、妊婦に安全に投与できます 58。 ReFrame ライブラリーに含まれる 14 種類の NS5A 阻害剤のうち、ヒット定義を満たしたのは TD-6450 のみでした。 TD-6450 は、その活性の増強を説明できる唯一のヘテロ二量体 NS5A 阻害剤です。 それにもかかわらず、この段階では階級効果を排除することはできません。 TD-6450 で観察された最大生殖母細胞保持率は、NITD609 のそれよりも低く、部分的な拮抗作用を思い出させます。 生殖母細胞集団には男性と女性が含まれており、抗生殖母細胞薬には性別に偏った効果があることが報告されています59。 私たちの研究でTD-6450で観察された有効性の読み出し依存性の違いは、男性では完全であり、女性では弱いか存在しない可能性がある、明らかに部分的な活性を説明する可能性があります。 この点についてしっかりとした確認が必要です。

in vitro で観察された IC50 は比較的高いにもかかわらず、TD-6450 には治療領域が存在すると考えられます。 モデリング データは、人口のほぼ 90% が、循環配偶母細胞の密度を低下させると予想される薬物血漿濃度に曝露されることを予測しています。 マラリア伝播の 3 つの主な決定要因は、末梢血中の生殖母細胞の濃度 (生殖母細胞血症)、ヒトの皮膚における生殖母細胞の潜在的な隔離、および増殖サイクル中の性的関与です。 それらのうち、配偶子赤血球血症のみが感染と強く相関しています60、61、62、63。 最近の研究 60 では、生殖母細胞 30/μl 以下の血液では感染したハマダラカは全く存在しないか、非常に少なく、感染したハマダラカの数は 200 ~ 250 生殖母細胞/μl よりも 50 生殖母細胞/μl の方が少なくとも 10 分の 1 でした。 したがって、生殖母細胞の 70 ~ 80% の除去を誘導する薬剤または薬剤の組み合わせは、寄生虫の生存能力に対する影響に関係なく、伝播に影響を与える可能性があります。 たとえ生きていても、脾臓に保持されている硬くなった生殖母細胞は、確かに蚊に刺されることができません。 TD-6450 の長い半減期と薬剤圧力の除去後の活性の持続性により、持続的な感染遮断効果が促進されることが期待されます。

成熟熱帯熱マラリア原虫生殖母細胞の脾臓保持に関する検証された動物モデルが存在しないため、ヒトでの研究が次のステップとなる。 最近のヒトチャレンジ研究では、ピペラキンによるボランティアの治療後に成熟生殖母細胞の持続的な循環が観察されました。 この結果は、新旧の薬剤の感染阻止の可能性を迅速かつ強力に評価するための道筋となります64。 ここで特定されたような薬剤は、脾臓の生殖母細胞クリアランスを誘導することで感染を阻止できる可能性があり、そのような評価の読み取り値は、薬剤投与後の生殖母細胞血症の単純な測定値となるでしょう。 標準的な膜栄養アッセイやマウスでの研究など、抗配偶子細胞薬の開発にとって非常に重要な前臨床情報は、私たちのアプローチの特定の状況では不可欠な前提条件です。 実際、配偶子血症の減少は感染の減少に直接関係しており、TD-6450 と NITD609 が配偶子血症を減少させる可能性があることを示唆する確かな結果が得られました。 マラリアの伝播を阻止する薬の開発は、倫理的、薬学的、物流上の課題に直面しています。 NITD609 と TD-6450 の潜在的な感染阻止効果が臨床試験で確認されれば、これらの安全な薬剤を兵器に加えることは、マラリアの持続的制御を目的とした独自のアプローチの推進に貢献する可能性があります。

Pathogen Box ライブラリ (400 化合物、スイス、ジュネーブの MMV-Medicine for Malaria Ventures から提供)、Kinase Inhibitors Box ライブラリ (350 化合物、GSK-Glaxo SmithKline DDW Unit、Tres Cantos、スペインから提供)、および ReFrame ライブラリ(米国カリフォルニア州ラホーヤのカリフォルニア生物医学研究研究所キャリバーによって提供された 12,805 化合物) を提供者の指示に従って使用しました。 DMSO 可溶化化合物 (10 mM ストック濃度) を 384 ウェル プレート (Seahorse、カタログ番号 201035-100) にロードしました。 コントロール用に 2 つの列を空のままにしました。 各化合物について、最終濃度 1.11 μM になるように 5 nL を単一のウェルに事前にスポットしました。 各ウェルの最終容量は45μlでした。 対照は次のように調製した。22.5 nLのDMSOを陰性対照として16ウェルにロードした(最終濃度0.05%)。 22.5 nL の NITD609 (MMV、スイス、ジュネーブより提供) 1 mM を 8 ウェルにロードし (最終濃度 0.5 μM)、17 nL のカリクリン A (Sigma、カタログ番号 C5552) 0.2 μM を 6 ウェルにロードしました (75最終濃度nM)および225nLのゲンチアナバイオレット(MolPort、カタログ番号002-133-551)10mMを残りの2つのウェルにロードした(最終濃度50μM)。 プレートは、Pathogen Box については 3 つ、キナーゼ阻害剤 Box については 6 つ用意されました。

熱帯熱マラリア原虫 NF54 株寄生虫 (スクリーニングキャンペーンに使用) は、以前に記載されているように、情報を与えられた献血者 (血液型 A) からの赤血球中で 4% ヘマトクリットで培養されました 65。 寄生虫を-80 °C の冷凍庫から取り出し、37 °C のウォーターバスで 1 分間急速に溶かしました。 溶解を避けるために生理食塩水を穏やかに加えた。 まず、NaCl を蒸留水に 12% (クライオバイアルで測定した体積の 1/5) で溶解し、次に NaCl を 1.6% (クライオバイアルの体積の 9 倍) で溶解しました。 その後、寄生虫の再増殖を可能にするために新鮮な RBC が追加されました。 感染したRBCを、10%の非補体化ヒト血清、ヒポキサンチン50mg/l(Sigma-Aldrich、カタログ番号H9636)を補充したRPMI培地(Sigma-Aldrich、カタログ番号R4130)中に維持した。 カスティーリャ・イ・レオンのバイオバンクとマドリッド輸血センターは、ヒト赤血球濃縮物の提供者です。 生殖母細胞の産生は、0.5% 環期寄生虫血症から誘導されました (0 日目)。 以前に記載されているように、配偶子細胞の分化を誘導するために培地を毎日交換しました66。 17 日目に、密度勾配培地 (NycoPrep 1.077、Progen カタログ番号 1114550) を使用して生殖母細胞を濃縮しました 27。 寄生虫血症は FACS (SYBR-Green および MitoTracker 二重染色、3 ~ 5% を標的) によって調整しました。 ヘマトクリットは、新鮮なRBCを添加することによって0.5%に調整し、ノイバウアーチャンバー(Celeromics、カタログ番号717810)内で手動計数することによって制御した。 最後に、生殖母細胞懸濁液を化合物を含む 384 ウェルマイクロプレートに注ぎ (45 μL/ウェル)、スクリーニングキャンペーンと用量反応分析の両方のために 24 時間インキュベートしました。 無性期と有性期の両方を、25 mM HEPES、50 mg/L ヒポキサンチン、50 μg/mL ゲンタマイシン、10% プール熱不活化ヒト血清 (A+) を補充した RPMI 1640 で培養しました。 血清の各バッチは、異なるドナーからの 10 個の血清バッグをプールすることによって得られました。 血清は-20℃に保ち、使用前に温水浴中で解凍しました。 前の血清バッチが完了したときに、新しい血清バッチが準備されました。 用量反応分析とマイクロ流体工学のために、3D7-pULG8-GFP67 と NF54 株 (BEI Resources、カタログ番号 MRA-1000) の両方をテストしました。 3D7株を、無性期および有性期の両方について、0.2%NaHCO3および2.5nMのWR99210を添加して、上記のように培養した。

大規模な顕微濾過は、前述のように実行されました27。 簡単に説明すると、Biomek NX ワークステーション (Beckman、カタログ番号 989402) を使用して顕微濾過プレートを調製し、25 ~ 45 μm のミクロスフェア 15 μl、次に 30% 5 ~ 15μm と 70% (w/w) の混合物 10 μl をロードしました。 –25μmのマイクロスフェア。 384 ウェル フィルター プレートは、使用するまで -20 °C で保管されました。 384 ウェルの顕微濾過プレートの一部では、1 つ以上のウェルでミクロスフェアの漏出が発生しました。 漏れのあるウェルは密閉した。 5つを超える密閉ウェルを示すプレートは使用しなかった。 イメージングプレートは、コラーゲンコートプレートの各ウェルに30μLの染色溶液をロードすることによって調製した。 各読み取り値 (1 および 2) には異なる染色溶液が使用されました。 読み取り 1 では、核酸 (Syto40、Thermo Fisher カタログ番号 S11351) および生存率 (MitoTracker Deep Red、Thermo Fisher カタログ番号 M22426) 染色を使用して雄と雌の生殖母細胞の両方を計数し、細胞膜染色 (CellMask) を使用して総 RBC を計数しました。オレンジ、サーモフィッシャー カタログ番号 C10045)。 読み出し 2 では、雌生殖母細胞の保持と死滅を選択的に定量化しました。 Cy3 蛍光色素 (GE Healthcare、カタログ番号 PA33000) と前方で結合した特異的な雌性配偶子マーカー (抗 pfs25、クローン 4B7、BEI Resources カタログ番号 MRA-315) をオーキネート培地 ( 25 mM HEPES、50 mg/リットル ヒポキサンチン、2 g/リットル重炭酸ナトリウム、100 μM キサンツレン酸、20% ヒト血清) を使用して雌性配偶子の活性化を誘導します18。 異なる細胞膜染色剤 (CallMask Deep Red、Thermo Fisher カタログ番号 C10046) もすべての RBC をカウントするために追加されました。 自動顕微濾過プロトコールは、真空ポンプに接続されたBiomek NX Workstation (Beckman、カタログ番号 989402) を使用して実行されました。 自動顕微濾過は前述のように実行されました27。 イメージングプレートを室温で一晩インキュベートした後、OperaPhenix ハイコンテンツ共焦点イメージング システム (Perkin Elmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で読み取り、Harmony ハイコンテンツ分析ソフトウェア v. 5.0 で分析しました。

イメージングプレートの分析から、生殖母細胞感染のパーセンテージは、生殖母細胞の数を総細胞数で割った値に基づいて計算されました。 これは、上流 (UP) サンプルと下流 (DS) サンプルに対して行われました。 殺害数は次の式を使用して計算されました。

定着率は、前述のとおり 25、次の式を使用して計算されました。

次に、殺傷率 (x 軸) と保持率 (y 軸) をグラフ化しました。 95% 予測バンドの回帰直線は、GraphPad Prism 5.1 ソフトウェアを使用して計算されました。 外れ値は線形回帰計算から除外されました。 両方の読み取り値で上部予測バンドの外にあった化合物のみが、最終的にヒットとして選択されました。 分析はプレートごとに行われました。 単一のスクリーニング プレートごとに、Z' パラメーターは前述のとおり 68、次の式を使用して計算されました。

ここで、RR は保持率の平均、SD は標準偏差、PC はポジティブコントロール (NITD609 0.5 μM)、NC はネガティブコントロール (DMSO 0.05%) です。

スクリーニング後の実験の統計分析に関しては、両側 P 値が 0.001 より劣る場合、通常の一元配置分散分析検定を事前に実行して検証しました。 ANOVA の後に、対応のある t 検定を実行して、個人差の両側 P 値を計算しました (図ではアスタリスクで示されています)。

用量反応分析(DRA)は、上で定義したように、選択された各ヒットの殺傷効果および硬化活性について行われました。 OperaPhenix の結果は、x 軸が化合物濃度を表し、y 軸が殺傷率または保持率を表すグラフで表されました。 GraphPad 5.1 Prism ソフトウェア (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、結果を対数形式に変換し、対数 (アゴニスト) 対応答曲線を追跡しました (可変勾配)。 死滅または保持の 50% が阻害される濃度 (IC50) は、次の曲線の方程式からソフトウェアによって計算されました。

ここで、B は底値、T は上部値、および ɣ は丘の傾きです。

固定用量分析と用量反応分析の両方を、一次スクリーニングから選択されたヒットを検証するために、第 2 のプロトコール (パリ研究所) に従って実行しました。 簡単に説明すると、生殖母細胞懸濁液を 96 ウェルの空のプレートにロードしました (200 μL/ウェル)。 各用量反応について、最初にウェル容量を 2 倍にし、最終濃度 10 μM になるように化合物を添加しました。 用量反応分析のために、生殖母細胞懸濁液を 12 ポイントで手動で 1/2 に連続希釈し、より低い濃度として 5 nM を得ました。 陰性対照を得るために、DMSOを用いて同じ操作を行った。 37 °C で 24 時間インキュベートした後、生殖母細胞懸濁液を 96 ウェル濾過プレート 28 にロードし、顕微濾過を 37 °C で手動で実行しました。 上流および下流のサンプルを Hoechst 33342 核染色 (PBS で 1/1000 希釈、Thermo Fischer カタログ番号 H3570) で 30 分間インキュベートし、洗浄し、200 µL の PBS に再懸濁してから、空の 96 ウェル プレートにロードしました。 FACSCanto (BD Biosciences、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国) による定量化。 細胞蛍光測定のデータは FlowJo V12 で分析されました。 この技術に関する前述の経験によると、マイクロビーズ層が飽和するリスクを回避するために、上流の配偶子血症が 10% を超えたときに顕微濾過実験を繰り返しました 25,69。

ImageStream X Mark II (Luminex の Amnis 一部) を使用したイメージング フローサイトメトリーを実行し、コンピューター ソフトウェア (IDEAS v 6.2、AMNIS) で処理した明視野画像 (倍率 60 倍) を使用して、熱帯熱マラリア原虫の成熟生殖母細胞に感染した赤血球のアスペクト比を決定しました。 )。 アスペクト比は、短軸を長軸で割った比率であり、オブジェクトがどの程度円形か長方形であるかを表します。 焦点を当てたセルと単一セルを選択してアスペクト比の特徴を分析し、セルの形状を記録しました。

熱帯熱マラリア原虫 3D7-pULG8-GFP または NF54 株は、ソルビトール溶解によって同調されました 70。 次に、リングを 0.5% 寄生虫血症に希釈し、空の 96 ウェル プレートにロードしました (200 μL/ウェル)。 まず、ウェル容量を 2 倍にし、化合物を添加して最終濃度 20 μM (TD-6450) および 500 nM (NITD609) を得ました。 次に、リング懸濁​​液を 12 ポイントについて手動で 1/2 に連続希釈し、最低濃度として 9.77 nM (TD-6450) および 0.24 nM (NITD609) を得ました。 陰性対照を得るために、DMSOを用いて同じ操作を行った。 48 時間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、RBC ペレットを Sybr-G (PBS で 1/1000 希釈、Thermo Fisher カタログ番号 S7567) とともに 30 分間インキュベートしました。 PBS 洗浄 (2 回) 後、ペレットを 200 μL の PBS に再懸濁し、寄生虫血症を FACSCanto で定量化し、FlowJo V12 で分析しました。 IC50 は、前述のように GraphPad Prism 5.1 を使用して決定されました。 光学顕微鏡による画像は、ライカ倒立顕微鏡を使用して取得され、Las X ソフトウェアで分析されました。

これは、健康な被験者(主目的)における TD-6450 の安全性と忍容性、および薬物動態を評価するための、二重盲検、無作為化、プラセボ対照、単回漸増用量(SAD)および複数漸増用量(MAD)の第 I 相試験でした。 (二次的な目的)。 この研究はウェブサイトclinicaltrial.gov(識別子NCT02022306)で入手でき、2014年2月4日に開始され(最初の被験者が登録)、2014年8月18日に終了した(最後の被験者が終了)、Healthcare Discoverys(ICONの子会社)で行われた。 Development Solutions)、米国テキサス州サンアントニオ。 この研究には、重大な病状の病歴がなく、BMIが18〜30kg/m2、体重が50kg以上、18〜60歳の健康で非喫煙者の被験者が選択されました。 被験者はインフォームドコンセントを与えることができ、また同意する意思がありました。 選考過程において偏りは報告されなかった。 この研究のプロトコールとすべての修正、および被験者に提供されたすべての付随資料(広告、被験者の情報シート、インフォームドコンセントを得るために使用された研究の説明を含む)は、研究者によって集中治験審査委員会(IRB)に提出されました。 、すなわち、IntegReview は、1999 年にオースティン (米国テキサス州) で設立され、2020 年に Advarra によって買収されました。文書による承認は、研究開始前の 2014 年 3 月 28 日に取得されました。この研究は、プロトコル、原則に従って実施されました。人間用医薬品登録のための技術的要件の調和に関する国際会議 (ICH) 適正臨床基準 (GCP) ガイドライン、米国連邦規則集、世界医師会ヘルシンキ宣言の原則、医療倫理原則人間を対象とした医学研究、および該当するすべての規制要件。

一次および二次アウトカムは次のように事前に定義されました: 安全性と忍容性は一次アウトカム、薬物動態は二次アウトカムです。 安全性と忍容性は、有害事象(AE)モニタリング、臨床検査(血液学、血清化学、凝固、尿検査)、バイタルサイン、身体検査、12誘導心電図(ECG)などの標準的な尺度を使用して評価されました。 有害事象は治験責任医師によって評価され、医薬品を投与された患者または臨床調査対象者における好ましくない医学的出来事であり、必ずしもこの治療法と因果関係を持たないものとして定義されました。 薬物動態は、以下の時点で各被験者から血液サンプルを採取することによって評価した:投与前(投与前30分以内、1日目のみ投与前60分)、および0.5、1、2、3、4、6、8および0.5、1、2、3、4、6、8、および投与から12時間後。 血液サンプルを分析して、以下の PK パラメーターを計算しました: AUC0-24: 注入後 0 時間から 24 時間までの血漿濃度対時間曲線の下の面積、AUC0-t: 時間 0 から 24 時間までの血漿濃度対時間曲線の下の面積定量可能な分析物濃度を含む最後のサンプル、AUC0-∞: 時間ゼロから無限までの血漿濃度対時間曲線の下の面積、Cmax: ピーク血漿濃度、Tmax: Cmax に達するまでの時間、最終排出半減期 (t1/2) CL/F: 口腔血漿クリアランス、Vz/F: 終末期の見かけの分布容積、Ae (尿中排泄量): 時間ゼロから測定可能な分析物濃度の最後のサンプルまでの尿中に排泄された累積量、Fe:尿中に排泄された用量の割合(TD-6450のみ)(1日目および14日目のMADのみ​​)、CLr:腎クリアランス。

この研究は、パート A (SAD) とパート B (MAD) の 2 つのパートで実施されました。 パート A では、登録された被験者の年齢は 20 ~ 60 歳の範囲であり、平均年齢範囲は 32.1 ~ 46.2 歳でした。 ほとんどの被験者は男性 (合計 73 名の被験者) であり、ほとんどは白人 (55 名の被験者) または黒人 (22 名の被験者) でした。 研究のパート B では、年齢は 23 歳から 60 歳の範囲であり、治療群全体で平均年齢は同様でした。 ほとんどの被験者は男性であり(合計 25 名の被験者)、全員が白人(18 名の被験者)または黒人(12 名の被験者)でした。 研究の各部分について、平均肥満指数(BMI)とクレアチニンクリアランスは治療群全体で同様でした。 関連性のある臨床的に重要な病歴を有する被験者はいなかった。 パート A: 健康な被験者を順次登録し、TD-6450 の単回投与またはプラセボのいずれかを投与するために、各用量コホート (食品効果コホートの給餌群を含め、最大 10 個の用量漸増コホートが計画された) にランダムに割り当てました。 各用量コホートについて、8 人の被験者が 3:1 の比率で無作為化されました (6 人の被験者が TD-6450 を受け、2 人の被験者がプラセボを受けました)。 TD-6450 の開始用量は 0.5 mg で、計画最大用量は 1000 mg でした。 500 mg コホートの PK データを検討した結果、500 mg 以上で曝露が飽和するため、1000 mg コホートにエスカレーションしないという決定が下されました。 以下の用量が投与された:0.5mg、1.5mg、5mg、15mg、30mg、60mg、120mg、240mg、および500mg。 パート B: 健康な被験者は、3 つの用量漸増コホート (TD-6450 60 mg、120 mg、240 mg) に順次登録され、TD-6450 またはプラセボのいずれかを 1 日 1 回、14 日間投与する群にランダムに割り当てられました。 各用量コホートについて、10 人の被験者が 4:1 の比率でランダム化されました (8 人の被験者が TD-6450 を受け、2 人の被験者がプラセボを受けました)。 各用量コホート後の盲検化された安全性、忍容性、入手可能な PK データは、パート A とパート B の両方について次の用量コホートにエスカレーションする前に、安全性データ検討委員会 (SDRC) によってレビューされました。臨床研究の被験者は各コホートにランダムに割り当てられました。 ランダム化コードが被験者に割り当てられました。 研究の実施に関与したすべての研究対象者、研究者、およびスポンサーのスタッフには、治療の割り当てについて知らされていなかった。 データベースがロックされる前にランダム化コードにアクセスできた唯一の職員は、ランダム化コードに従って被験者に投与する薬剤またはプラセボのカプセルを調製した薬剤師または薬局スタッフ、および PK サンプル (血漿および血漿) を分析した生物分析契約研究所です。尿)。

各被験者の治験薬には、割り当てられた被験者への正しい投与を容易にするために適切にラベルが付けられました。 被験者の治療割り当てに関するすべての文書(つまり、ランダム化コード、薬物責任記録)は安全な場所に保管され、盲検でない薬局スタッフのみがアクセスでき、これらの個人は被験者管理のいかなる側面にも関与しませんでした、症例報告書調剤記録以外の、プロトコルによって要求される (CRF) 入力、モニタリング、または報告。 医療上の緊急事態が発生した場合、または用量漸増目的で盲検化が解除された場合、治験薬の正体は臨床現場で盲検化が解除されているはずです。 医療上の緊急事態が発生した場合、薬剤師または権限のあるスタッフに提供された一連の密封された緊急コードを使用して、個々の被験者のランダム化コードが破られる可能性があります。

この研究は探索的な性質を持っているため、コホート サイズを決定するために正式な検出力やサンプル サイズの計算は使用されませんでした。 SAD 研究のサンプルサイズは 88 人の健康な被験者 (コホートあたり 8 人の被験者)、MAD 研究のサンプルサイズは 30 人の健康な被験者 (コホートあたり 10 人) であり、この設定内で PK と安全性の評価の適切な特徴付けが提供されるはずです。 スクリーニング時の対象者は、年齢が 18 ~ 60 歳(両端を含む)、BMI が 18 ~ 30 kg/m2(両端を含む)、体重が少なくとも 50 kg で、臨床的に重大な症状がないことによって判断される健康状態が良好であった。疾患または臨床的に重大な異常な検査値(スクリーニングまたは-1日目)。 この研究は、米国テキサス州サンアントニオにある Healthcare Discoveries (ICON Development Solutions の子会社) で実施されました。

データは、2 つの健康なボランティア研究、1 つは単回漸増用量 (SAD) ともう 1 つは複数漸増用量 (MAD) から集められました。 観察された濃度データは自然対数に変換され、NONMEM v7.4 (Icon Development Solution、Ellicott City、MD) の非線形混合効果モデリングを使用して評価されました。 Pirana v3.0、Perl-speaks-NONMEM (PsN) v4.8.1、および Xpose バージョン 4.7.1 は、モデル構築プロセス中の自動化、モデル評価、および診断に使用されました。

さまざまな構造分布モデル (1、2、および 3 コンパートメント モデル) とさまざまな吸収モデル (一次吸収およびトランジット コンパートメント (n = 1 ~ 10) モデル) が評価されました。 個人間の変動と同じパラメータの共変量の影響を評価するために、集団の相対バイオアベイラビリティを 1 に固定しました。 体重は、体重 80 kg の典型的な患者を対象に固定アロメトリック関数 (クリアランス パラメーターの指数 0.75、体積パラメーターの指数 1.0) として評価されました。 その他の生物学的に妥当な共変量パラメータ関係(すなわち、すべてのパラメータに対する性別と年齢、排泄クリアランスに対する投与量と治療期間、吸収率と相対的生物学的利用能、吸収率と相対的生物学的利用能に対する併用食物摂取、および排泄クリアランスに対するクレアチニンクリアランス)は、段階的加算 (p < 0.05) および消去 (p < 0.001) アプローチで評価されました。 前方ステップのすべての重要な共変量は線形関数と非線形関数の両方で評価され、最もパフォーマンスの高いモデルが後方消去ステップでも保持されました。 薬物動態パラメータは対数正規分布すると仮定され、個人間変動 (IIV) および場合間変動 (IOV) は指数関数として実装されました。 10% 未満の推定 IIV は最終モデルでは削除され、IOV は吸収パラメーターのみに基づいて推定されました。

モデルの適合性は、主に目的関数値 (OFV; データの -2 × 対数尤度に比例して NONMEM によって計算) によって評価されました。 2 つの階層モデル間のモデル識別は、OFV のカイ二乗分布に基づく尤度比検定によって決定されました (つまり、自由度差 1 で、ΔOFV > 3.84 に対応する p 値 < 0.05)。 適合度は、開発されたモデルの記述パフォーマンスを評価するために使用されました。 予測および変動補正された視覚的予測チェック (pvcVPC、n = 2000 シミュレーション) を使用して、開発されたモデルの予測パフォーマンスを評価しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この論文に関連するすべてのデータは、本文または補足資料に含まれています。 この研究で生成された ReFrame ライブラリの一次 in vitro スクリーニングの結果は、アクセッション コード A00279 で Reframe データベース (https://reframedb.org/assays/A00279) に保管されています。 この論文で説明されている第 I 相臨床試験 (ID: NCT02022306) は、clinicaltrials.gov データベース (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=&term=NCT02022306&cntry=&state=&city=&dist=) に保管されています。アクセッションコード NCT02022306。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

病原体ボックスを提供してくださった Medicines for Malaria Venture (MMV) とキナーゼ阻害剤ボックスを提供してくださった GSK に感謝いたします。 教授に感謝します。 Pietro Alano は熱帯熱マラリア原虫株 3D7 pULG8-GFP を提供し、Françoise Benoit-Vical は株 F32-TEM を提供しました。 プロジェクト全体を批判的にレビューしてくださった MMV の Jeremy Burrows 氏と Didier Leroy 氏、および顧みられない病気の治療薬イニシアチブ (DNDi) の Laurent Fraisse 氏に非常に感謝しています。 私たちは、ここで説明する臨床試験のスポンサーである Theravance Biopharma Inc. と、試験のデータを収集して分析し、この論文に利用できるようにしてくれた元上級副社長の Brett Haumann (研究のスポンサー署名者) と Philip Worboys に感謝します。常務理事ウェイン・イェーツ氏の絶え間ないサポートに感謝します。 また、GSK の Maria Jesùs Almela-Armendariz 氏と Jorge Fernandez Molina 氏の技術サポートにも感謝いたします。 私たちは、Bill & Melissa Gates Foundation の助成金 OPP1123683 と、Tres Cantos OpenLab Foundation の PB が取得した助成金 TC180 に感謝します。また、NIH (R01HL154150) から MD への支援、そして HRA Pharma と André Ulmann から JD への支援にも感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Mario Carucci、Julien Duez。

パリ シテ大学、Inserm、UMR-1134、赤血球の統合生物学、75015、パリ、フランス

マリオ・カルッチ、オーレリー・フリコ=モンサンジョン、アブドゥライ・シソコ、リュシー・デュマ、バベット・ベーエル、パスカル・アミロー、カミーユ・ルーセル、パパ・アリオヌ・ンドゥール、ピエール・ビュッフェ

SYNSIGHT、91000、エヴリー・クールクロンヌ、フランス

ジュリアン・デュエズ

マヒドン・オックスフォード熱帯医学研究ユニット、熱帯医学学部、マヒドン大学、10400、バンコク、タイ

ジョエル・ターニング

オックスフォード大学ナフィールド医学部、熱帯医学および国際保健センター、オックスフォード、英国

ジョエル・ターニング

Mycology Reference Laboratory、国立微生物学センター、Instituto de Salud Carlos III、28222、マドリッド、スペイン

アイリーン・ガルシア=バルバザン

Global Health Medicines R&D、GlaxoSmith Kline (GSK)、28760、Tres Cantos、スペイン

パブロ・ガマーロ、ローラ・マリア・サンス、フランシスコ・ハビエル・ガモ

血液疾患の細胞および分子機構と治療への影響の研究室、INSERM、75014、パリ、フランス

パスカル・アミロー & マイケル・デュシオ

ラボラトリー オブ エクセレンス GR-Ex、パリ、フランス

マイケル・デュシオ & カミーユ・ルーセル

マサチューセッツ工科大学材料科学工学部、マサチューセッツ州、02139、ケンブリッジ、米国

ミンダオ

Calibr、スクリップス研究所の一部門、ラホーヤ、カリフォルニア州、92037、米国

ミッチェル・V・ハル & ケース・W・マクナマラ

一般血液学研究所、ネッカー小児病大学病院、パリ公立病院支援 (AP-HP)、75015、パリ、フランス

カミーユ・ルーセル

感染症・熱帯病科、AP-HP、ネッカー病院、75015、パリ、フランス

ピエール・ビュッフェ

パスツール研究所医療センター (CMIP)、パスツール研究所、75015、パリ、フランス

ピエール・ビュッフェ

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MC は原稿を書き、スクリーニングアッセイのセットアップに貢献し、スクリーニングとスクリーニング後の実験を実行しました。 JD はスクリーニングアッセイを設定しました。 IG-B。 一次審査キャンペーンの技術サポートを提供しました。 BB、AF-M.、AS、LD は、スクリーニング後の検証実験に対する技術サポートを提供しました。 PA と CR はイメージング フローサイトメトリー実験を監督しました。 MD はイメージング フローサイトメトリー実験を実施しました。 MD は、一次スクリーニングの回帰分析に基づいてスクリーニング データの解釈を確立しました。 PG は一次スクリーニング分析に貢献しました。 CWM と MVH は、ReFrame ライブラリに関連するすべての技術サポートと情報を提供しました。 PAN は結果と原稿を批判的にレビューしました。 FJG と LSA は共同で GSK DDW の一次審査キャンペーンを監督しました。 PB はプロジェクト全体を構想し、実験活動を監督および調整し、原稿を執筆および編集しました。 著者全員が原稿を批判的にレビューしました。

ピエール・ビュッフェへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Julian Rayner と他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Carucci、M.、Duez、J.、Tarning、J. 他。 マラリアの伝播を阻止する可能性が高い安全な薬剤が、脾臓模倣スクリーニングによって明らかになりました。 ナットコミューン 14、1951 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37359-2

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受信日: 2022 年 7 月 20 日

受理日: 2023 年 3 月 15 日

公開日: 2023 年 4 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37359-2

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