がん免疫療法に対する抵抗性を克服するためにTBK1を標的にする

Nature volume 615、pages 158–167 (2023)この記事を引用

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黒色腫やその他のがんにおける PD-1 阻害は成功していますが、がん免疫療法に対する抵抗性を克服するための効果的な治療戦略は不足しています 1,2。今回我々は、プールされた遺伝子スクリーニング4において、自然免疫キナーゼであるTANK結合キナーゼ1（TBK1）3を免疫回避遺伝子の候補として同定した。複数の実験モデル系にわたる一連の遺伝的および薬理学的ツールを使用して、免疫回避遺伝子としてのTBK1の役割を確認しました。 TBK1 を標的にすると、エフェクターサイトカイン (TNF および IFNγ) に対する細胞毒性閾値が低下するため、PD-1 遮断に対する応答が強化されます。 PD-1 遮断と組み合わせた TBK1 阻害は、患者由来の腫瘍モデルを使用した場合にも有効性を示し、一致する患者由来の器官型腫瘍スフェロイドと一致する患者由来のオルガノイドで一致した所見が得られました。 TBK1 を欠く腫瘍細胞は、JAK-STAT 依存的に TNF および IFNγ に応答して RIPK およびカスパーゼ依存性の細胞死を受けるように準備されています。まとめると、我々の結果は、TBK1 を標的とすることが癌免疫療法に対する抵抗性を克服する効果的な戦略であることを示しています。

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この研究で生成および分析されたデータセットは、記事とその補足情報に含まれています。 in vivo scRNA-seq データは、アクセッションコード GSE217160 (in vivo TBK1i 研究) および GSE217274 (in vivo TBK1 CRISPR-Cas9 研究) で GEO に寄託されており、リクエストに応じて入手できます。分析の説明は、方法とレポートの概要に記載されています。

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この研究は、NIH K08CA226391 (RWJ へ)、P01CA24023 (SIP へ)、K99CA259511 (KP へ)、T32CA207021 (JHC へ)、5R01AR072304 (DEF へ)、5P01CA163222 (DEF へ)、5R01AR043369 (to DEF) および 5R01CA222871 ( DEFまで）。追加の支援は、メラノーマ研究同盟若手研究者賞 (https://doi.org/10.48050/pc.gr.86371、RWJ に)、Karin Grunebaum がん研究財団教員研究フェローシップ (RWJ に)、テルメール初期キャリアによって提供されました。システム薬理学のフェローシップ (RWJ へ) および SB および JW Belkin からの贈り物。 KP は、ドイツ研究財団 (DFG)、Stand Up to Cancer ペギー・プレスコット初期キャリア科学者賞 PA-6146、Stand Up to Cancer フィリップ A. シャープ賞 SU2C-AACR-PS-32 からの支援に感謝します。 DJ は Susan Eid Tumor Heterogeneity Initiative を認めています。そしてDEFはミリアム博士とシェルドン・G・アデルソン医学研究財団からの助成金支援に感謝します。資金提供団体は、研究の計画、データの収集、分析、解釈、あるいは原稿の執筆には何の役割もありませんでした。 MGH、HMS、ブロード研究所のマングソ研究室とジェンキンス研究室のメンバー全員に感謝します。図のグラフィックス。 2a と 5i は BioRender を使用して作成されました。

この作品は次の著者が共同で監修しました: Robert T. Manguso、Russell W. Jenkins

マサチューセッツ総合病院がんセンター、ハーバード大学医学部、マサチューセッツ総合病院医学部、米国マサチューセッツ州ボストン

イー・スン、オーヤム・レヴァチ、アミナ・フー、シャン・マー、ジア・グウィー、シンドゥラカール王子、ジュン・ティアン、アルナブ・メータ、モシェ・サデ＝フェルドマン、トーマス・ラサール、ホンヤン・シエ、ロドリゴ・サード＝ベレッタ、キャスリーン・B・イェーツ、アンジェリーナM. Cicerchia、Martin Q. Rasmussen、Samuel J. Klempner、Dejan Juric、David M. Miller、Jonathan H. Chen、Karin Pelka、Dennie T. Frederick、Debattama R. Sen、Ryan B. Corcoran、Nir Hacohen、Keith T. . フラハティ、ロバート・T・マングーソ & ラッセル・W・ジェンキンス

MIT とハーバード大学のブロード研究所、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

セス・アンダーソン、エミリー・A・ケスラー、クララ・H・ウルフ、エミリー・J・ロビチェック、トーマス・GR・デイヴィス、サラ・キム、パヤル・ティワリ、ピーター・P・ドゥ、アルナブ・メータ、アレクシス・M・シュナイダー、モシェ・サデ＝フェルドマン、キャスリーン・B・イェーツ、アービン・イラチェタ＝ベルヴ、ジョナサン・H・チェン、カリン・ペルカ、ニル・ハコーエン、ジュヌヴィエーブ・M・ボーランド、ロバート・T・マングーソ、ラッセル・W・ジェンキンス

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部、ハーバード大学治療科学プログラム、システム薬理学研究室

アン・ジェニー、ケイトリン・E・ミルズ、シャミン・リュー、ヨハン・KE・スペッツ、秦シンピン、クリストファー・A・サロシーク、ピーター・K・ソーガー、ラッセル・W・ジェンキンス

米国マサチューセッツ州ボストンのダナ・ファーバー癌研究所腫瘍内科

アルナブ・メータ、エレナ・イワノワ、アミール・R・アレフ、クラウド・P・パウェレツ、デヴィッド・A・バービー

マサチューセッツ工科大学生物工学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

アレクシス・M・シュナイダー

イスラエル、ハイファ、テクニオン工科大学ラパポート医学部細胞生物学および癌科学部門

ケレン・イザク

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部、マサチューセッツ総合病院がんセンター外科、腫瘍外科部門

タチアナ・シャロワ、ウィリアム・A・ミショー、サラ・I・パイ、ジュヌヴィエーブ・M・ボーランド

分子統合生理学プログラム、ハーバード大学公衆衛生大学院、ボストン、マサチューセッツ州、米国

ジョン・KE・スペッツ、秦星平、クリストファー・A・サロシエク

ジョン B. リトル放射線科学センター、ハーバード公衆衛生大学院、ボストン、マサチューセッツ州、米国

ジョン・KE・スペッツ、秦星平、クリストファー・A・サロシエク

分子および細胞腫瘍形成プログラム、ウィスター研究所、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、米国

ガオ・チャン

プレストン・ロバート・ティッシュ脳腫瘍センター、デューク大学医学部脳神経外科、米国ノースカロライナ州ダーラム

ガオ・チャン

プレストン・ロバート・ティッシュ脳腫瘍センター、デューク大学医学部病理学部、米国ノースカロライナ州ダーラム

ガオ・チャン

ムーアズがんセンター、UC サンディエゴ、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

キム・ヨンウク

新規治療学センター、UC サンディエゴ、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

キム・ヨンウク

カリフォルニア大学サンディエゴ校医学部、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

キム・ヨンウク

米国マサチューセッツ州ボストン、マサチューセッツ総合病院皮膚科およびハーバード大学医学部皮膚生物学研究センター

マック・Y・スー & デヴィッド・E・フィッシャー

システム生物学センター、マサチューセッツ総合病院、米国マサチューセッツ州ボストン

サラ・I・パイ

米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部皮膚科

デビッド・M・ミラー

米国マサチューセッツ州ボストン、ダナ・ファーバー癌研究所データ科学部生物統計部門

アニタ・ジョビー・ハーダー

米国マサチューセッツ州ボストン、マサチューセッツ総合病院病理学部

ジョナサン・H・チェン

ギリアド・サイエンシズ、米国カリフォルニア州フォスターシティ

スザンナ・スティンソン

ベルファー応用癌科学センター、ダナ・ファーバー癌研究所、米国マサチューセッツ州ボストン

エレナ・イワノバ、アミール・R・アレフ、クラウド・P・パウェレツ、デヴィッド・A・バービー

Xspera Biosciences、米国マサチューセッツ州ボストン

アミール・R・アレフ

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概念と実験計画: YS、O.-yR、SA、CEM、PT、KBY、AI-V.、RTM および RWJ 方法論とデータ収集: YS、O.-yR、SA、EAK、CHW、AJ、CEM、 EJR、AF、XM、JG、PT、AMC、MQR、PS、JT、AM、HX、TS、SL、WAM、RS-B、JKES、XQ、GZ、MYS、JWK、SJK、DTF、DJ、SIP 、DMM、SS、EI、ARA、CPP、DRS、GMB データの分析と解釈: YS、O.-yR、SA、CEM、PT、TGRD、SK、PPD、JT、AM、AMS、KY、MS-F .、TL、JWK、KAS、AG-H.、JHC、KP、DAB、DEF、RBC、NH、PKS、KTF、GMB、RTM、RWJ 原稿執筆および改訂: YS、O.-yR、SA、CEM、 HX、DJ、DAB、RTM、RWJ

ラッセル・W・ジェンキンスへの通信。

RWJ は、Xsphera Biosciences の諮問委員会のメンバーであり、Xsphera Biosciences に金銭的利害関係を持っています。Xsphera Biosciences は、体外プロファイリング技術を使用して、患者、医療提供者、医薬品開発会社に機能的で高精度の免疫腫瘍学ソリューションを提供することに注力している企業です。 AM はサードロックベンチャーズ、アッシャーバイオセラピューティクス、アバタセラピューティクスのコンサルタントです。また、Asher Biotherapeutics および Abashi Therapeutics の株式を保有しています。 SIP は、Abbvie、Astrazeneca/MedImmune、Cue Biopharma、Fusion Pharmaceuticals、MSD/Merck、Newlink Genetics、Oncolys Biopharma、Replimmune、Scopus Biopharma、Sensei Biopharma からコンサルタント料の支払いを受けています。彼女は、Abbvie、Astrazeneca/MedImmune、Cue Biopharma、Merck、Tesaro から助成金/研究支援を受けています。 SJK は、イーライリリー、メルク、BMS、アステラス製薬、第一三共、ピエリス、ナテラのコンサルタント/顧問の役割を果たしてきました。 Turning Point Therapeutics の株式を所有しています。 DJ は、Novartis、Genentech、Syros、Eisai、Vibliome、Mapkure、Relay Therapeutics からコンサルティング料を受け取りました。ノバルティス、ジェネンテック、シロス、ファイザー、エーザイ、武田薬品、ファイザー、リボン・セラピューティクス、インフィニティ、インベンティスバイオ、アルビナスとの契約研究を実施。 Relay Therapeutics および PIC Therapeutics の所有権を保有しています。 DMM は、Checkpoint Therapeutics、EMD Serono、Castle Biosciences、Pfizer、Merck、Regeneron、Sanofi Genzyme の諮問委員会に参加することで謝礼金を受け取りました。チェックポイント・セラピューティクス社の株式を所有しています。 DEFは、皮膚を黒くする局所治療用の塩誘導性キナーゼ阻害剤を開発している会社であるSoltegoに金銭的関心を持っており、この会社は広範なヒトへの応用に使用される可能性がある。 RTMはブリストル・マイヤーズスクイブ社にコンサルティングを行っています。 MS-F. ブリストル・マイヤーズスクイブ社から研究資金を受けています。

Nature は、ロバート・ブラッドリー氏、佐藤敏郎氏、その他の匿名の査読者の、この研究の査読への貢献に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、Cas9 発現 B16 黒色腫細胞によって発現される 2,368 個の遺伝子を標的とする sgRNA のプールからの Ikbke sgRNA の相対的な枯渇/濃縮 (各遺伝子を標的とする n = 4 の独立したガイド; 偽発見率 (FDR) は、STARS アルゴリズム v1.3 を使用して計算されました) 、前述したように6,7)。 b、コントロールおよびTbk1ヌルB16細胞におけるTBK1およびβ-アクチンタンパク質レベル。結果は 3 つの独立した実験の代表です。 c、1〜4日間のインビトロ培養後のTbk1ヌルおよび対照B16腫瘍細胞の増殖（3つの独立した実験からの条件当たりn = 9）。 d、NSGマウスにおける対照（灰色）、Tbk1ヌル（薄赤色）B16腫瘍の腫瘍体積（グループあたりn = 5マウス）。平均腫瘍体積（黒丸）を+/- sem（影付き領域）で示す。 Sidak の多重比較検定を使用した 2 元配置分散分析。 e、抗PD-1治療を受けたコントロールsgRNA-1（黒色）、sgRNA-2（灰色）、Tbk1 sgRNA-1（ピンク）、およびTbk1 sgRNA-2（赤色）B16腫瘍の腫瘍体積分析のスパイダープロット野生型 C57BL/6 マウス (図 1c を参照)。 fg、コントロール（黒）、抗PD-1（灰色）、TBK1i（ピンク）、および抗PD-1+TBK1i（赤）B16腫瘍の腫瘍体積分析（f）および生存（g）のスパイダープロット。 C57BL/6 マウス (図 1d を参照)。生存分析 (g) では、生存 (g) のログランク (マンテル-コックス) 検定を使用してペアワイズ検定を実行しました。 n = 治療グループあたり 10 匹のマウス、***P < 0.001; ns、対照群と比較して有意ではない。 h、示された治療の14日目におけるB16-ova腫瘍を有するマウスの体重。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (グループあたり n = 10 匹のマウス、テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析; ns、有意ではありません)。 i、指示された治療法によるCT26 MDOTSの生存率評価。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 3、生物学的反復、テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; * *** P < 0.0001)。 j〜k、TBK1i、抗PD-L1、またはその組み合わせで治療したMC38（j）およびMB49（k）腫瘍を有するマウスの腫瘍体積分析（対照（IgG + ビヒクル）と比較）。 n = 治療グループあたり 10 匹のマウス。平均腫瘍体積（黒丸）を+/- sem（影付き領域）で示す。 Tukey の多重比較検定を使用した 2 元配置分散分析 ***P < 0.001; 対照群との比較。

ａ、腫瘍の種類、組織源（位置）、臨床応答データ、ＰＤＯＴＳ応答データ、およびＰＤＯＴＳプロファイリングに使用される検体に関する関連腫瘍変異プロファイル（抗ＰＤ－１＋ＴＢＫ１ｉの組み合わせに対する生体外のＰＤＯＴＳ応答によって順序付けられたサンプル）。 PDOTS 応答パラメーターは次のように定義されます: 応答者 (対照と比較して >30% の減少)、部分応答者 (対照と比較して <30% の減少および <20% の増加)、および非応答者 (対照と比較して >20% の増加)。灰色の四角形の周囲の赤い境界線は、指定された遺伝子に変化が存在することを示します。 b、黒色腫患者からのPDOTSの生存率に対するIgG4対照モノクローナルAbの効果。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 3、生物学的反復、両側対応のない t 検定)。

a-b、CD45+ 細胞の 11 クラスターの tSNE プロット（a）免疫チェックポイント遮断に応答性（R）または非応答性（NR）の転移性黒色腫患者由来（Sade-Feldman et al. 2018 を参照）、および t- CD3E (T 細胞)、CD14 (骨髄細胞)、および CD19 (B 細胞) の TBK1 および IKBKE 発現の色を示す、RNA 配列決定された単一細胞の SNE プロット (b)。 c〜d、広範なクラスターの割合（c）および示された治療グループ全体のクラスターあたりの細胞の割合（d）。 e〜f、再クラスター化されたリンパ系（T / NK）細胞のUMAP（c）および密度（d）プロット。 g、リンパ系 (T/NK) 細胞のクラスターの割合。平均値 (バー) と個別の値 (丸) は +/- sem (誤差バー) で表示されます。複数の対応のない t 検定、*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; **** P < 0.0001; ns、重要ではありません。 h、再刺激あり/なしでTBK1i(1μM)またはDMSO(0.1%)で前処理された活性化(CD69+CD25+)マウスCD8+脾細胞の割合。 n = 3 つの生物学的に独立したサンプル、二元配置分散分析、シダックの多重比較検定。 *P < 0.05; ***P < 0.001。 i-k、TBK1i (1 μM) または DMSO (0.1%) で前処理したマウス CD3+CD8+ 脾細胞の TNF (i)、IL-2 (j)、および IFNγ (k) の細胞内サイトカイン染色 (再刺激あり / なし)データは％ CD69+CD25+ 細胞および MFI として示されます）。 n = 3 つの生物学的に独立したサンプル、二元配置分散分析、シダックの多重比較検定。 **P < 0.01; **** P < 0.0001; ns、重要ではありません。

a、抗PD-1で処理した対照腫瘍およびTbk1ヌルB16腫瘍からの免疫集団のフローサイトメトリー（各グループn = 4）。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 4 の生物学的に独立したサンプル、両側対応のない t 検定)。 bc、抗 PD-1 治療後のコントロールおよび Tbk1 ヌル B16 腫瘍からの 31,810 個の RNA 配列決定された単一細胞の UMAP (b) および密度 (c) プロット (DC、樹状細胞、Treg、制御性 T 細胞、MDSC、骨髄性誘導サプレッサー細胞、NK、ナチュラルキラー細胞、M1、M1 マクロファージ、M2、M2 マクロファージ）。 d、系統で定義された各クラスター内の細胞のパーセント。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 4 の生物学的に独立したサンプル、二元配置 ANOVA、Sidak の多重比較検定、統計的有意性に達しなかった M1 マクロファージおよび CD8 T 細胞の P 値を示します)。 e、参照された細胞タイプ（b）によるTbk1およびIkbke発現の色付けを含む、RNA配列決定された単一細胞のUMAPプロット。 f、UMAPで定義された細胞クラスター全体にわたるTbk1およびIkbkeの発現を示すバブルプロット。

a、参照された細胞タイプでのIfngおよびTnf発現の色付けを含む、RNA配列決定された単一細胞のUMAPプロット（右）。 b、系統が定義された細胞クラスター（Tbk1-null/コントロール）全体でのIfng（薄赤色）およびTnf（薄青色）発現の対数倍変化。

a、相対的な sgRNA 遺伝子の枯渇/濃縮を示す火山プロット。枯渇した sgRNA の上位 5 つを示します。 b、インビトロCRISPRスクリーニングからの遺伝子本質性の散布図(コントロールおよびTbk1ヌルB16細胞)。 c、ポリクローナル対照およびTbk1ヌルB16細胞に由来する単一細胞クローンのTBK1発現および細胞生存率(対照対TNF/IFNγ;)。ウェスタンブロットは 3 つの独立した実験の代表です。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (2 つの独立した実験にわたる n = 6、2 元配置 ANOVA、Sidak の多重比較検定; **** P < 0.0001; ns、有意ではありません)。 d、コントロール sgRNA および Tbk1 sgRNA B16 単一細胞クローンからの TBK1 インデルスペクトル。 e、TNF (160 ng ml-1) + IFNγ (40 ng ml-1) で 24 時間処理した後の標準 2D 培養における B16-ova 細胞の生存率評価 (Cell Titer Glo) と、未刺激細胞との比較 (n = 6、2)独立した実験、一元配置分散分析、ホルム・シダックの多重比較検定）。 f、TNF (10 ng ml-1) + IFNγ (10 ng ml-1) で 96 時間処理した後の 3D マイクロ流体培養における B16 腫瘍スフェロイド (免疫細胞を欠く) の生存率評価 (Hoechst/ヨウ化プロピジウム) と未刺激細胞との比較 ( n = 6、2 つの独立した実験、一元配置分散分析、ホルム-シダックの多重比較検定)。 g、TNF (200 ng ml-1) + IFNγ (40 ng ml-1) で 24 時間処理した後の B16 細胞の細胞生存率評価を、漸増濃度の MRT67307 で処理した未刺激細胞と比較した (n = 9、3 つの独立した実験 2- ANOVA、Sidak の多重比較検定など）。 h、TNF (200 ng ml-1) + IFNγ (40 ng ml-1) で 24 時間処理した後の標準 2D 培養における B16 細胞の細胞生存率評価。GSK8612 の濃度を増加させて処理した未刺激細胞と比較した (n = 3、1)独立した実験、二元配置分散分析、シダックの多重比較検定）。 i、漸増濃度のTBK1 PROTAC 3iによるTNF（200 ng ml-1）+IFNγ（40 ng ml-1）で24時間処理した後の標準2D培養におけるB16細胞の細胞生存率評価（n = 6、2つの独立した実験2） -way ANOVA、Sidak の多重比較検定)。 **** P < 0.0001; ns、重要ではありません。

a、親、コントロール sgRNA (ポリクローナルおよびモノクローナル)、および Tbk1 sgRNA (ポリクローナルおよびモノクローナル) B16 細胞における TBK1i の 9 点阻害剤滴定の GR 値 (2 つの独立した実験; 条件ごとに 6 回の技術的反復による単一実験の代表データ) 。平均値 (黒丸) は +/- sem (エラーバー) で示されています。 b-c、TBK1i 効力の評価（b; 最大効果の半分、GEC50）および全体的な有効性（c; GR 曲線上の面積、GRAOC）d-e、親（d）および BRAF/MEK 阻害剤の GR 値のヒートマップ耐性（ e ）0、0.25、および1.0μM TBK1iを用いて、濃度を増加させながら24、24、および72時間処理したA375ヒト黒色腫細胞（n = 3）。

a-b、RIPK1 阻害剤 (Nec-1s、10 μM) および汎カスパーゼ阻害剤 Q-VD-OPh (10 μM) で前処理したコントロールおよび Tbk1 ヌル B16 細胞における細胞生存率評価 (Cell Titer Glo) + /− TNF/IFNγ (n=3、1 つの独立した実験: 2 元配置分散分析、ダネットの多重比較検定)。 b、RIPK1阻害剤（Nec-1s、10μM）および汎カスパーゼ阻害剤z-VAD-fmk（20μM）で前処理した対照細胞およびTbk1ヌルB16細胞における細胞生存率評価（Cell Titer Glo）+/- TNF/IFNγ (n = 3 ～ 6、1 ～ 2 の独立した実験: 2 元配置分散分析、ダネットの多重比較検定)。 c、RIPK1阻害剤（Nec-1s、10μM）およびカスパーゼ8阻害剤z-IETD-fmk（2.5μM）+/-TNF/IFNγで前処理したTbk1ヌルB16細胞における細胞生存率評価（n = 6、 2 つの独立した実験; 2 元配置 ANOVA、ダネットの多重比較検定)。 d、RIPK3阻害剤（HS-1371、2μM）および汎カスパーゼ阻害剤Q-VD-OPh（20μM）+/- TNF/IFNγで前処理したTbk1ヌルB16細胞における細胞生存率評価（n = 6）、2 つの独立した実験: 2 元配置分散分析、ダネットの多重比較検定)。 e、MLKL阻害剤（GW806742X、5μM）および汎カスパーゼ阻害剤Q-VD-OPh（20μM）+/- TNF/IFNγで前処理したTbk1ヌルB16細胞における細胞生存率評価（n = 6、2）独立した実験: 2 元配置分散分析、ダネットの多重比較検定)。 fh、TNF (10 ng ml-1)、IFNγ (10 ng ml-1)、またはコントロール (0.1% DMSO)、Q-VD-OPh (20 μM) を含む TNF + IFNγ で処理した B16 細胞のクローン原性アッセイRIPK1阻害剤Nec-1s（10μM、f）、RIPK3阻害剤HS-1371（2μM、g）、およびMLKL阻害剤GW806742X（2μM、h）を含まない（代表的な画像を示す; n = 3）。 i、コントロール細胞と比較した、TNF (10 ng ml-1)、IFNγ (100 ng ml-1)、またはその両方で処理した B16 細胞における選択された遺伝子の正規化発現 (バルク RNA 配列のソースデータ – Manguso et al. 2017）。 j、qRT-PCRによって測定された、TNF/IFNγ処理(18時間)あり/なしの対照およびTbk1ヌルB16細胞におけるMlk1およびRipk3の正規化発現(n=3;二元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定)。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; **** P < 0.0001; ns、重要ではありません。 k、ビヒクル対照（0.1％DMSO）、Q-VD-OPh（20μM）、Nec-1s（10μM）、またはQで2時間前処理した後のTbk1ヌルB16細胞溶解物中の示されたタンパク質のウェスタンブロット-VD-OPh と Nec-1s、または Q-VD-OPh とビリナパント (1 μM) の後に、TNF (160 ng ml-1) および IFNγ (40 ng ml-1) または非刺激 (PBS) コントロールで 10 時間処理。データは 3 つの独立した実験の代表です。

a、未刺激の対照（sg1およびsg2）およびTbk1ヌル（sg1およびsg2）B16細胞のインビトロBH3プロファイリングにおけるシトクロムC（cyt C）放出%のヒートマップ。平均値を示します。 n=3 の生物学的に独立したサンプル。二元配置分散分析、ダネットの多重比較検定。 b、コントロール sgRNA および Tbk1 sgRNA B16 細胞の in vitro BH3 プロファイリングにおけるチトクロム C (cyt C) 放出率のヒートマップ。平均値を示します。 n = 3 生物学的に独立したサンプル; 2 元配置 ANOVA、Tukey の多重比較検定。どの時点でも、コントロール sgRNA 細胞と Tbk1 sgRNA B16 細胞の間に統計的に有意な差は観察されませんでした。 c、対照およびTbk1ヌルB16細胞における示された濃度のスタウロスポリン(STS)で24時間処理した後の、標準的な2D培養におけるB16細胞の生存率評価(Cell Titer Glo)。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 6、2 回の独立した実験、二元配置分散分析、シダックの多重比較検定)。 d、48時間処理後の3Dマイクロ流体培養におけるB16腫瘍スフェロイド（免疫細胞を欠く）の生存率評価（ヘキスト/ヨウ化プロピジウム）は、未刺激細胞と比較したスタウロスポリン（STS）の濃度を示した。平均値（バー）および個別の値（白丸）は、を示します (n = 6、2 つの独立した実験、一元配置分散分析、ホルム-シダックの多重比較検定)。 e、コントロール sgRNA と比較した、Tmem173、Irf3、および Tbk1 を標的とするシングルガイド RNA を含む単一 CRISPR 細胞株による B16 細胞における STING、IRF3、TBK1、および β-アクチンのウェスタンブロット。データは 3 つの独立した実験の代表です。 f、示された sgRNA ペアを含む二重 CRISPR B16 細胞における STING、IRF3、TBK1、および β-アクチンのウェスタンブロット。データは 3 つの独立した実験の代表です。 g、未刺激細胞と比較した、TNF (160 ng ml-1) + IFNγ (40 ng ml-1) で48時間処理した後の示されたsgRNA B16細胞の生存率評価(Cell Titer Glo)。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 4 生物学的反復、二元配置分散分析、シダック多重比較検定、**P < 0.01; **** P < 0.0001; ns、有意ではありません)。 h、適応治療を受けた皮膚黒色腫患者 (n = 2) からの PDOTS 生存率評価。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n = 6 生物学的複製、2 つの独立した標本; ダンの多重比較検定による一元配置分散分析、**P < 0.01; **** P < 0.0001; ns、重要ではありません)。 i、示された治療に応じた PDOTS からの馴化培地の分泌サイトカインプロファイル (L2FC) のヒートマップ (n = 2)。平均値を示します。 **P < 0.01; **** P < 0.0001; ns、重要ではありません。

a、TNF (10 ng ml-1) および IFNγ (10 ng ml-1) によるインビトロ刺激 +/- Tbk1 ヌル B16 細胞における標的ごとのすべての sgRNA の濃縮の頻度ヒストグラム (z スコア)。 b、Cas9+ B16 コントロールおよび Tbk1 sgRNA 細胞株における 19,674 遺伝子を標的とする sgRNA の相対的枯渇を示す散布図 +/- TNF (10 ng ml-1) および IFNγ (10 ng ml-1) による in vitro 刺激。 c、TNF (160 ng ml-1) および IFNγ (40 ng ml-1) で指定の時間処理したコントロール sgRNA および Tbk1-null B16 細胞のウェスタンブロット。データは 3 つの独立した実験の代表です。 d、未刺激の対照と比較した、TBK1i（1μM）+/- JAK 1/2阻害剤（ルキソリチニブ、0.5μM）+/- TNF/IFNγで48時間前処理した親B16細胞における細胞生存率評価。平均値 (バー) と個々の値 (白丸) を示します (n=3、1 つの独立した実験; 2 元配置 ANOVA、ダネットの多重比較検定; *P < 0.05; ***P < 0.001; **** P < 0.0001; ns、有意ではありません)。 e、ビヒクル対照（0.1％DMSO）、ルキソリチニブ（1μM）、Q-VD-OPh（20μM）、Nec-1sで2時間前処理した後のTbk1ヌルB16細胞溶解物中の示されたタンパク質のウェスタンブロット（ 10μM）、またはQ-VD-OPhプラスNec-1s、その後TNF（160ng ml-1）およびIFNγ（40ng ml-1）または未刺激（PBS）対照で10時間処理。データは 3 つの独立した実験の代表です。 f、親細胞、対照 sgRNA (モノクローナル)、および Tbk1 sgRNA (モノクローナル) B16 細胞におけるルキソリチニブ (JAK1/2i) の 9 点阻害剤滴定の GR 値 (2 つの独立した実験; 条件ごとに 6 回の技術的反復による単一実験の代表データ) ）。平均値 (黒丸) は +/- sem (エラーバー) で示されています。

補足図。 1～13。 scRNA-seq 用の遺伝子発現マトリックス、フローサイトメトリー用のゲーティング戦略、およびウェスタンブロット分析用のトリミングされていない画像。

PDOTS 臨床病理学的データ。

B16 細胞における in vitro CRISPR スクリーニングの sgRNA 枯渇および濃縮データ。

主要人物のサポートデータ。

拡張データ数値のサポートデータ。

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転載と許可

Sun, Y.、Revach, Oy.、Anderson, S. 他がん免疫療法に対する抵抗性を克服するためのTBK1の標的化。 Nature 615、158–167 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05704-6

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受信日: 2021 年 7 月 16 日

受理日: 2023 年 1 月 4 日

公開日: 2023 年 1 月 12 日

発行日: 2023 年 3 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05704-6

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