メトトレキサートに対するパンプキンシードオイルの潜在的な役割

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7321 (2023) この記事を引用

452 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

多くの化学療法薬は肺に有害な反応を引き起こし、重篤な肺疾患を引き起こします。 メトトレキサート (MTX) は癌やその他の病気の治療に使用されますが、毒性が高く、肺毒性を含む複数の副作用があります。 エッセンシャル オイルは、その幅広い薬理学的特性により、薬学にとって開かれたフロンティアを表しています。 カボチャ種子油 (PSO) を使用して、ラットのメトトレキサート誘発肺毒性を軽減する能力を調査しました。 MTX治療群の肺組織では、コリンエステラーゼ活性の顕著な阻害を伴うマロンジアルデヒド、グルタチオン、一酸化窒素の減少、カタラーゼ活性、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-6、血管内皮増殖因子レベルの亢進が明らかになった。 PSO の分析により、この油にはヘキサデカン酸、デカンメチルエステル、スクアレン、ポリデカン、ドコサン、およびその他の誘導体が豊富に含まれていることが判明しました。 PSO の投与により、肺組織における MTX によって誘発される酸化剤/抗酸化剤および炎症促進性の変化が改善されました。 組織学的検査により、MTX によって誘発される組織病理学的変化を軽減する PSO の効力が確認されました。 免疫組織化学的分析では、PSO 後に核因子カッパ B およびカスパーゼ 3 の発現が減少していることが示されました。 今回のデータは、酸化損傷、炎症、アポトーシスを減少させることにより、MTX 誘発性肺損傷に対する PSO の保護効果を示しており、したがってアジュバント療法として推奨できる可能性があります。

化学療法剤は固形腫瘍および血液悪性腫瘍に広く使用されています。 化学療法によって誘発される肺疾患は、肺疾患および救命救急の専門家にとって特別な課題です1。 多くのがん化学療法薬は間質性肺炎/線維症を引き起こす可能性があり、これは薬剤性肺損傷に関連する最も一般的な臨床症状です2。

メトトレキサート (MTX) は、ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) を競合的に阻害し、プリンおよびピリミジン合成の主要な炭素供与体であるジヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸への変換を妨害する葉酸拮抗薬です。 メトトレキサートは、その治療効果により、さまざまな種類の固形臓器悪性腫瘍の治療のための抗腫瘍剤として使用されています。 特定の種類のがんの治療には高用量の MTX が使用されましたが、1990 年以降はリウマチ性疾患の治療にはるかに低用量で使用されています4。 MTX は、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、小血管炎など、他のいくつかの疾患の治療にも有効であることが示されています5、6。

しかし、MTX は細胞毒性が高く、複数の潜在的な副作用を引き起こすことが報告されています。 これは、腎毒性 7、肝毒性 8、肺毒性 9、心血管毒性 10、胃腸粘膜炎 11 などの関連毒性の発生率が高いため、MTX の使用を制限していました。 過敏性肺炎は、MTX12 に関連する肺毒性の最も一般的なタイプです。 MTX 亜急性肺炎は、健康診断で呼吸困難、非湿性咳嗽、発熱、頻呼吸を伴うパチパチ音などの症状が現れ、MTX クローン病患者の約 10% で肺線維症が観察されます 13。

ウリ科のカボチャ (Cucurbita spp.) は、一年生のつる植物であり、16 世紀以来ヨーロッパで知られている伝統的な食品です。 いくつかの研究は、多くの病気に対するカボチャ種子油 (PSO) の保護効果を強調しています。 抗がん作用 14、抗糖尿病作用 15、抗酸化作用 16、抗炎症作用 17、細胞保護作用 18、および抗変異原作用 19 の効能が報告されています。 Al-Okbi ら 17 は、PSO が血漿腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) およびマロンジアルデヒド (MDA) レベルの上昇を有意に阻害し、それによって関節炎ラットモデルの炎症の重症度を軽減し、炎症性および酸化性の有意な改善をもたらしたと報告しました。ストレスバイオマーカー。

したがって、本研究は、酸化剤（マロンジアルデヒドおよび一酸化窒素）および抗酸化剤（グルタチオン、カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ）のパラメータ、および炎症誘発性サイトカイン（インターロイキン、 6およびTNF-α）は、成体雄ラットの肺組織に存在します。 さらに、コリンエステラーゼ酵素の活性と血管新生に関与する血管内皮増殖因子のレベルを推定しました。 PSO の活性成分を特定するために PSO の分析が行われました。 核因子カッパ-B とカスパーゼ 3 の両方の免疫組織化学的検査に加えて、肺組織の組織病理学的検査も実施されました。

体重 160 ～ 200 g の成体雄アルビノラット 40 匹を地元の業者から購入しました。 全ての動物は、カイロ大学理学部動物学科の動物舎のケージ内で、標準的な光と温度の条件下（12時間の明/暗）で飼育された。 ラットには標準的な毛皮の固形飼料を与え、水を自由に与えた。 実験開始前に、動物を適応させるために約４日間観察下に置いた。 すべての実験手順は、カイロ大学施設内動物管理使用委員会 (CU-IACUC) No. CU/I/F/72/19 の承認に従って行われました。 研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。 すべての方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。

メトトレキサートは、Mylan Company (フランス) によって供給されました。 PSO は、天​​然油および化粧品の Elhawag Company (エジプト) からライセンス番号 1000 で購入されました。 グルタチオン、ヨウ化アセチルチオコリン、5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸 (DTNB)、およびリン酸緩衝液は、Sigma Aldrich から入手しました。

この実験では 40 匹のラットを使用し、4 つのグループに分けました (各グループに 10 匹のラット)。 対照群（Cont）、カボチャ種子油（PSO）群、メトトレキサート（MTX）群、およびMTX + PSO群。 対照群には、生理食塩水 (0.9% NaCl) を 1 回腹腔内 (ip) 注射し、続いて 7 日間連続して生理食塩水を経口投与しました。 2 番目のグループは PSO グループで、連続 7 日間、1 ml/kg20 の用量で経口胃管栄養法を用いてラットにカボチャ種子油 (PSO) を毎日注射しました。 3 番目のグループは、Saygin et al.21 に従って 20 mg/kg の用量で MTX を 1 回腹腔内注射し、続いて連続 7 日間生理食塩水を経口投与する MTX グループです。 4番目のグループはMTX + PSOグループで、動物はMTX (20 mg/kg) の単回腹腔内注射とその後のPSO (1 ml/kg) で連続7日間治療されました。

ラットは、麻酔なしで突然首を切り取られて屠殺された。 断頭後、各動物の肺組織を慎重に取り出し、氷冷した生理食塩水で洗浄し、濾紙で吸い取り、次に肺の右半分を氷冷したガラス板上で切り出し、さらなる分析のために凍結した。 ５ｍｇの各凍結肺組織を５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。 ホモジネートを 3000 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離し、得られた上清をさらなる生化学的調査まで -25 °C で保存しました。 処理されたすべてのラットの肺の残りの半分は、組織病理学および免疫組織化学的調査のために準備されました。

PSO の GC/MS 分析は、Thermo Scientific、Trace GC Ultra/ISQ Single Quadrupole MS、TG-5MS 溶融シリカキャピラリー カラム (30 m、0.251 mm、膜厚 0.1 mm) を使用して実行されました。 GC/MS 検出には、イオン化エネルギー 70 eV の電子イオン化システムを使用しました。 ヘリウムをキャリアガスとして 1 ml/分の一定流量で使用しました。 インジェクターと MS トランスファーラインの温度は 280 °C に設定されました。 オーブン温度は、初期温度 40 °C (3 分間保持) から最終温度として 280 °C まで、5 °C/分 (5 分間保持) の上昇速度でプログラムされました。

同定されたすべての成分の定量化は、相対ピーク面積パーセントを使用して調査されました。 化合物の暫定的な同定は、相対的な保持時間および質量スペクトルと、GC/MS システムの NIST、WILLY 9 ライブラリ データとの比較に基づいて実行されました。

マロンジアルヒド (MDA; 脂質過酸化の最終生成物) は、Ohkawa et al.22 の方法に従って、キット番号 MD 2529 (Biodiagnostic、エジプト) を使用して、ラット肺組織ホモジネート中で測定されました。 チオバルビツール酸 (TBA) と MDA の反応は、酸性媒体中で 95 °C の温度で 30 分間行われ、チオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) が形成されます。 サンプルおよび標準の吸光度を、Helios Alpha Thermospectronic (UVA 111615、England) 分光光度計で 534 nm でブランクに対して読み取った。 肺組織ホモジネート（サンプル）中のマロンジアルヒド含有量を、nmol/g組織で測定した。

GSH 濃度は、Beutler et al.23 によって記載された方法に基づくキット番号 GR 2511 (Bio Diagnostics、エジプト) を使用して測定されました。 この方法は、5,5' ジチオビス (2-ニトロ安息香酸) (DTNB) をグルタチオンで還元して黄色の化合物を生成することに基づいています。 還元された色原体は還元されたグルタチオン濃度に正比例し、その吸光度は 405 nm で分光測光的に測定されました。 GSH濃度はmmol/g組織で表した。

一酸化窒素 (NO) は、酵素一酸化窒素合成酵素 (NOS) によって生体系で合成されます。生体内での NO の最終生成物は、亜硝酸塩 (NO2-) と硝酸塩 (NO3-) です。 NO含有量の測定は、酸性媒体中のGriess試薬の添加に依存するMontgomeryおよびDymock24の方法に従って実施した。 グリース試薬は亜硝酸塩を深紫色のアゾ化合物に変換します。 形成された亜硝酸はスルファニルアミドをジアゾ化し、生成物はN-(1-ナフチル)エチレンジアミンとカップリングします。 形成された赤紫アゾ染料の吸光度を、Helios Alpha Thermospectronic (UVA 111615、England) 分光光度計で 540 nm で分光測光的に測定した。

ラット肺組織ホモジェネートにおけるカタラーゼ活性は、キット番号CA 2517（Biodiagnostic、エジプト）を使用するAebi25の方法によって測定した。 このメソッドは、CAT と既知量の H2O2 の反応に基づいており、CAT の各単位は 25 °C、pH 7.0 で 1 分あたり 1 μM の H2O2 を分解します。 カタラーゼ阻害剤を使用すると、正確に 1 分後に反応が停止します。 ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ (HRP) の存在下で、残りの H2O2 が 3,5 ジクロロ-2-ヒドロキシベンゼン スルホン酸 (DHBS) および 4-アミノフェナゾン (AAP) と反応して、色の強度が反比例するキノン イミン色素を形成します。サンプル中のカタラーゼの量に応じて調整します。 H2O2 の分解に続いて、240 nm での吸光度が減少しました。 単位時間あたりの吸光度の差が CAT 活性の尺度になります。

肺組織ホモジェネート中のスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) 活性は、Nishikimi et al.26 の手順に従ってアッセイされました。 このアッセイは、ニトロブルーテトラゾリウム色素のフェナジン メト硫酸媒介反応を阻害する SOD の能力に依存します。 SOD は、スーパーオキシドアニオンの酸素分子と過酸化水素への不均化を触媒します。 ブランクとサンプルについて、吸光度の増加を 25 °C、560 nm で 5 分間測定しました。

本研究では、Gorun et al.28 によって説明されている Ellman et al.27 の方法の修正を使用しました。 この方法では、アセチルチオコリンの加水分解が進行する際のチオコリンの生成速度を測定します。 ChE をアセチルチオコリンとともに特定の時間インキュベートし、その後、発色指示薬 DTNB を含む試薬で反応を停止します。 色は412 nmで即座に読み取られ、ChE活性はμmol SH/g組織/分(SHスルフヒドリル基)として測定されました。

腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) は、SinoGeneClon Biotech Co., Ltd. (杭州、中国) から入手したラット TNF-α Elisa キット、カタログ番号 SG-20127 を使用して測定しました。 発色した色をマイクロタイタープレートリーダーを使用して450nmで読み取った。 次いで、濃度を標準曲線から計算した。

インターロイキン 6 (IL-6) は、SinoGeneClon Biotech Co., Ltd. (杭州、中国) から供給されたラット インターロイキン 6 Elisa キット カタログ番号 SG-2026 を使用して測定しました。 色の変化は、マイクロタイタープレートリーダーを使用して450nmの波長で測定されました。 次いで、サンプル中のIL-6の濃度を標準曲線から決定した。

血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、SinoGeneClon Biotech Co., Ltd.（杭州、中国）から購入したラット血管内皮増殖因子 Elisa キット、カタログ番号 SG-20402 を使用して測定しました。 色の変化は450nmの波長で測定されました。 次いで、サンプルの光学密度を標準曲線と比較することによって濃度を計算した。

肺切片をさまざまなグループから収集し、組織病理学的および免疫組織化学的評価のために 10% 中性緩衝ホルマリンに保存しました。 アルコール脱水およびパラフィン包埋ステップの後、組織をスライドガラス上で 5 μm の厚さに切断しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン染色 (H&E) を使用して組織切片を染色しました。 肺切片は明視野顕微鏡（Olympus BX43）を使用して検査され、デジタル画像は固定デジタルカメラ（Olympus DP27）を使用して取得されました。 肺スコアシステムは前述のように実行されました29。

肺宗派。 （５μｍ）をパラフィンブロックから正に帯電したガラススライドに切り出した。 脱パラフィンと再水和の通常のステップは、一連の段階的アルコールを介して実行されました。 熱誘発エピトープ回復を実施した。 肺切片を洗浄し、その後ウシ血清アルブミン (BSA) を使用してタンパク質をブロックし、過酸化水素を適用しました。 その後、一次抗体（マウスモノクローナル抗NF-κB p65（sc-8008））をカスパーゼ-3（sc-65497、Santa Cruz Biotechnology Inc.、ダラス、テキサス州、米国）とともに1:150の希釈で一晩インキュベートしました。その後、組織切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 標識ヤギ抗マウス二次抗体 (Abcam、ケンブリッジ、英国) とともに 2 時間インキュベートし、その後 3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) 基質検出キット ( Thermo Scientific) を適用しました。マイヤーヘマトキシリンを使用して対比染色を行い、脱水に続いてキシレンクリアランスを行い、ジブチルフタレートポリスチレンキシレン (DPX) にマウントしました。デジタルソフトウェア (Cell Sens Dimensions、Olympus ソフトウェア) を使用して陽性反応の面積 % を定量化しました。ネガティブコントロールステップ一次抗体のインキュベーションステップを省略することで達成されました。

すべてのデータは、平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表されました。 有意性は p < 0.05 で決定されました。 異なる動物群の平均値と対照動物の平均値との間の比較は、時間間隔ごとに一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して実行されました。 すべての統計分析は、SPSS (社会科学のための統計パッケージ、バージョン 14) を使用して行われました。 統計的に有意な場合、多重比較のための事後検定として、ANOVA 検定の後にダンカン検定が行われました。

すべての実験手順は、カイロ大学施設内動物管理使用委員会 (IACUC) No. CU/I/F/72/19 の承認に従って行われました。

カボチャ種子油 (PSO) 成分の同定は、相対保持時間および質量スペクトルと NIST、GC/MS システムの Willy 9 ライブラリ データの比較に基づいて行われました。 未知の成分のスペクトルは、Willy 9 ライブラリに保存されている既知の成分のスペクトルと比較されました。 試験物質の成分の保持時間、名前、分子量、構造を確認しました。 PSO の GC/MS 分析により、植物の薬効に寄与する植物化学成分とそのピークが示されました (図 1)。 PSO の有効成分を保持時間と組成パーセンテージで特定したところ、この研究で使用した PSO にはヘキサデカン酸 (42.06%)、デカンメチルエステル (25.9%)、スクアレン (11.16%)、ポリデカン (5.56%) が豊富に含まれていることが明らかになりました。 )、ドコサン (2.56%)、およびその他の誘導体 (表 1)。

Trace GC Ultra / ISQ シングル四重極 MS、TG-5MS 溶融シリカ キャピラリー カラムを使用した、カボチャ種子油 (PSO) から同定された化合物のクロマトグラムとスペクトル。

MTX を 1 回腹腔内注射すると、8 日間の治療後に成体雄ラットの肺の MDA レベルが顕著に減少しました (図 2)。 観察された MDA レベルの減少は、対照群と比較して p 値 〜 0.05 で有意であり、-26.72% のパーセンテージ差を記録しました。 連続８日間のＰＳＯの経口投与は、対照群と比較して、ラットの肺におけるＭＤＡレベルのわずかな非有意な増加を誘発した。 MTXを注射したラットをPSOで処理すると、MDAレベルの変化が防止された。

マロンジアルデヒド (MDA) (I)、グルタチオン (GSH) (II)、一酸化窒素 (NO) (III) レベルおよびカタラーゼ (CAT) (IV)、スーパーオキシド ジスムターゼ (メトトロキサート中毒ラット肺における SOD) (V)、およびコリンエステラーゼ (ChE) (VI) 活性。 異なる文字は、有意に異なる平均値を示します (p 値 ~ 0.05)。 同じ文字は重大な変更がないことを示します。

MTX の腹腔内注射は、対照群および PSO で治療した MTX グループと比較して、MTX 治療ラットの肺の GSH レベルの有意な減少を引き起こしませんでした (図 2)。 しかしながら、ＰＳＯの毎日の経口投与は、対照値と比較して、ＭＴＸ＋ＰＳＯ処置ラットの肺組織中のＧＳＨ含量の有意ではない増加を誘導した。

図 2 に示されたデータは、成体雄ラットへの 1 回の MTX 注射が、肺記録における NO レベルの顕著な減少を誘発したことを明らかにしました - 対照レベルより 49.13% 低い。 PSOの経口投与は、対照値と比較して、ラット肺組織におけるNOレベルを-49.13%から-37.68%にわずかに改善した。

このデータは、MTX を注射されたラットが CAT 活性の有意な増加を示し、対照値より 44.3% 高いことを示しました。 MTX 中毒ラットを PSO で処理すると、対照群と比較して 41.1% のパーセンテージ差で CAT 活性の増加が誘導されました (図 2)。

調査したグループの肺組織におけるSODの活性に関するデータを分析したところ、PSOおよびMTXの単独または併用処理後の酵素活性のわずかな低下のみで、有意な変化は見られませんでした（図2）。

単回の MTX 注射により、コリンエステラーゼ酵素活性の顕著な阻害が誘導され、対照値より 40.5% 低い値を記録することがわかりました (図 2)。 MTX 中毒ラットを PSO で 8 日間毎日治療すると、酵素活性の改善が得られ、-34.8% でしたが、それでも対照群よりも大幅に低かったです。

MTXの単回腹腔内注射は、ラットの肺におけるTNF-αレベルの有意な上昇を誘導し、対照値に対して19.10%のパーセンテージ差を記録した(図3)。 MTX中毒ラットをPSOで8日間毎日治療すると、肺組織におけるTNF-αの増加が改善され、対照群と比較してパーセンテージの差が-5.11%に低下した。

腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) (I)、インターロイキン 6 (IL-6) (II)、および血管内皮増殖因子 (VEGF) (III) レベルに対するカボチャ種子油 (PSO) の経口投与の影響メトトレキサート中毒のラットの肺。 異なる文字は、有意に異なる平均値を示します (p 値 ~ 0.05)。 同じ文字は重大な変更がないことを示します。

PSO処理ラットの肺組織におけるインターロイキン-6（IL-6）のレベルは、対照群と比較して有意ではない減少（-31.77％）を示しました（図3）。 逆に、MTX注射はIL-6の有意ではない増加を引き起こし、対照群よりも26.93%高かった。 MTX注射したラットにPSOを8日間毎日経口投与すると、MTX注射によるIL-6の増加が減弱され、パーセンテージの差は26.93％から2.32％に減少した。

MTXを注射したラットの肺組織では、VEGFレベルの顕著な増加が記録されました（図3）。 観察された増加は、コントロールおよび PSO グループに対して p 値 ~ 0.05 で有意であり、コントロール値と比較して 45.98% を記録しました。 MTXを注射したラットをPSOで処理すると、8日間の処理後にVEGFレベルの非有意な減少が誘導され、パーセンテージの差はMTX後の45.98%からPSO後の-26.89%に減少した。

対照群および PSO 群からの肺切片は、検出可能な変化のない肺組織の正常な組織学的構造を示しました。 逆に、MTX グループの検査では重度の肺損傷が明らかになりました。 間質組織は、大量の浮腫および可変の出血領域を伴う多数の単核炎症細胞浸潤により著しく拡張した。 気管支および細気管支は、その管腔内に、脱落した上皮細胞、炎症細胞および組織残骸と混合した粘液滲出液を示した。 MTX 中毒ラットに PSO を投与すると、肺胞および肺胞間中隔を占める炎症性細胞浸潤の数が減少し、軽度の浮腫および出血が起こることを特徴とする肺組織の顕著な保護が誘導されました。 肺スコアリングシステムでは、評価したすべてのパラメーターにおいて、対照群または PSO 群と比較して MTX 群の有意な増加が明らかになりました。 しかし、浮腫と炎症に関しては、MTX+PSO群はMTX群に比べて有意な減少を示しました（図4）。

MTX 誘発性肺損傷 (H&E) からの肺組織の回復に対する PSO の効果。 対照群およびPSO群は、肺胞、気管支および間質組織の正常な組織学的構造を示した。 MTX グループは、豊富な浮腫と重度の単核炎症細胞浸潤を伴う重度の間質性肺炎を示し、より高い倍率 (20 倍) では、細気管支内腔が粘液性滲出液と落屑した上皮細胞を伴う炎症細胞で閉塞していることが示されました。 MTX + PSO グループは、肺実質における炎症反応の顕著な減少を示しました。 グラフは、さまざまなグループの肺スコア損傷を表します。 値は平均値 ± SE として表されます。 @ Con から重要、# MTX から重要。 有意差は p < 0.05 で考慮されます。

カスパーゼ-3 と NF-kβ の評価は、異なるグループの肺切片で実施されました。 カスパーゼ-3免疫染色に関しては、対照およびPSOは肺胞内層および間質組織において弱い発現から陰性発現を示した。 しかし、MTX グループの間質組織、肺胞、気管支の内層上皮および細気管支では、カスパーゼ 3 の強い陽性発現が検出されました。 MTX + PSO グループでは中程度の発現が検出されました。 NF-kβ免疫染色でも同様の結果が得られました。 発現面積％の統計分析では、カスパーゼ-3およびNF-kβ染色に関して、他のグループと比較してMTXグループの有意な増加が示されました（図5）。

異なるグループにおけるカスパーゼ-3およびNF-kβの免疫組織化学的染色。 コントロールおよび PSO グループは、両方のマーカーで限定的なまたは陰性の発現を示しました。 MTX は、炎症を起こした肺切片においてカスパーゼ-3 および NF-kβ に関して強い陽性発現を示しました。 カスパーゼ-3 と NF-kβ の両方の MTX + PSO グループで免疫染色の顕著な減少が検出されます。 グラフは、さまざまなグループの免疫マーカーの発現面積%を表します。 値は平均値 ± SE として表されます。 @ Con から重要、# MTX から重要。 有意差は p < 0.05 で考慮されます。

肺損傷は、薬物誘発性の肺毒性または自己免疫介在性炎症によって生じる可能性があります12。 MTX の治療上の使用は、その毒性 21 によって制限されており、投与量の変更や完全な休薬につながります 12。

本研究における炎症マーカーである TNF-α、IL-6、および VEGF のレベルの上昇は、肺組織に対する MTX の細胞傷害性炎症促進効果を明確に示しています。 炎症誘発性サイトカインの増加は、MTX がこれらのサイトカインの発現と分泌を上方制御する能力によって説明され、これにより ROS の生成とその後の肺組織損傷がさらに促進される可能性があります。

他の臓器と比較して、肺は高レベルの大気中の酸素に直接さらされるため、非常に脆弱です。 したがって、呼吸上皮は酸化ストレスの主要な標的となります。 したがって、肺の酵素的および非酵素的抗酸化防御システムは豊富であり、酸化剤による損傷から肺を保護するのに非常に効率的です30。

本研究は、ラットの肺において、1 回の MTX 注射により、酸化マーカーである MDA および NO の含有量が大幅に減少し、GSH レベルと SOD 活性が有意ではない減少を引き起こすことが明らかになりました。 しかし、MTXを注射したラットの肺組織ではCAT活性の上昇が記録されました。

酸化ストレスは細胞生体膜へのラジカル媒介損傷を誘発し、脂質過酸化を引き起こします。これにより、DNA、タンパク質、その他の高分子を修飾できる酸化生成物の生成が引き起こされます 31。 活性酸素種 (ROS) は、主要な細胞高分子を標的とし、酸化的損傷に応じて細胞の損傷とその後の細胞死を引き起こします。 これは組織損傷の発症と進行を引き起こし、酸素は活性なフリーラジカルへの曝露を増加させる可能性があります32。 MTX によって誘発される現在の炎症は、ROS の生成が進行中である可能性を示唆しています。 CAT 酵素の増加はこの考えを裏付けています。

本研究の病理組織学的検査結果は、MTX治療群における重度の肺損傷を示し、多数の単核炎症細胞を含む間質組織の顕著な拡大、浸潤、多量の浮腫、および気管支の内腔および細気管支の混合した粘液滲出物を伴う可変出血領域を明らかにした。脱落した上皮細胞、炎症細胞、組織残骸が含まれています。 同様に、MTX 誘発性肺毒性は、過形成を伴う間質性リンパ球浸潤、小さな肉芽腫性領域の形成、および場合によっては好酸球性浸潤を特徴とする過敏性肺炎 33、閉塞性肺炎、急性間質性肺炎、肺線維症、およびその他の症状を示す他のパターンと相関していることが示されています。胸水34．

現在の所見は、MTX35 後のラット肺における MDA レベルの増加と CAT および SOD 活性の減少と報告されているものとは一致しません。 これは、本研究で適用された短い時間間隔によって説明される可能性があります。 したがって、SODの活性とGSHのレベルは、対照と比較して変化しませんでした。 しかし、MTX後のCAT活性の現在の増加は、この酵素が肺組織におけるフリーラジカルの生成に応答する最初の抗酸化物質であることを示唆しています。

本研究で観察された組織病理学的変化は、MTX に起因する重度の肺損傷を示しています。 組織損傷が進行すると、最終的には細胞死による MDA レベルの減少につながります。 いくつかの組織病理学的研究により、MTX 誘発肺傷害が重大なリンパ球炎症および肺細胞過形成、上皮変性および線維組織沈着を伴ううっ血を引き起こすことが明らかになりました 36。 気腔の内側を覆う肺上皮細胞が損傷すると、粘液分泌が増加し、肺への好中球の流入が増加し、転写因子と炎症誘発性メディエーターの遺伝子発現が活性化されます37。 これは、MTX 処置ラットの肺切片の気管支および細気管支の内腔におけるさまざまな細胞および組織残骸の間の粘液滲出物の存在を説明する。

カタラーゼは、過酸化水素の水と酸素への不均化を触媒します 38。 肺では、CAT は肺胞 II 型肺細胞およびマクロファージに局在しています 39。 これは、肺で最も耐性のある細胞型である II 型肺細胞において外因性過酸化水素を消費する最も重要な抗酸化酵素であると考えられています 40。 本研究では、MTX注射後の肺組織におけるCAT活性の有意な増加は、酸化ストレスが増大した条件下で肺を保護する主要な抗酸化物質としてのカタラーゼの重要性を強調している。

人間の呼吸器系には、NOS の 3 つのアイソフォームが存在します。 ニューロン NOS (nNOS) は、非アドレナリン作動性、非コリン作動性神経系、気道神経および上皮で検出されました。 内皮性 NOS (eNOS) は主に肺血管系の内皮細胞に存在しますが、誘導性 NOS (iNOS) は炎症促進性および抗炎症性反応と関連しています。 すべてのアイソフォームは L-アルギニンを L-シトルリンに変換し、一酸化窒素を放出します41。 それらの活性に何らかの変化が生じると、NO レベルの変化が生じ、さまざまな呼吸器疾患の発症に寄与する可能性があります42。

eNOS は TNF-α やその他の炎症刺激によって活性化されることが報告されています 43。 MTX によって誘導される炎症性サイトカインの上昇による eNOS の活性化により、ペルオキシ亜硝酸を生成するスーパーオキシドラジカルと相互作用する NO の生成が引き起こされる可能性があることが示唆されています 44。 これは強力な酸化剤であり、重要なタンパク質の不可逆的な機能不全を引き起こすチロシンのニトロ化によって直接的に、または細胞毒性を持つ他の反応性分子の生成を開始することによって間接的に細胞損傷を引き起こす可能性があります42,45。 NO は、血管の拡張を維持し、血圧を制御する内皮に血管保護効果を及ぼすことが報告されています 46。NO の減少は、その血管保護効果を妨げ、その結果、肺組織における MTX 毒性を促進する可能性があります。

いくつかの研究は、PSO14、15、16、17、18、19 の有望な治療効果を指摘しています。 今回の結果により、ラット肺における MTX 誘発生化学的変化を軽減する PSO の能力は、連続 8 日間の PSO 投与後に明らかであることが明らかになりました。 PSOは、対照値と比較して、ラット肺組織におけるMDAおよびGSHレベルをほぼ対照レベルに維持し、NOレベルをわずかに改善した。 MTX を注射したラットを PSO で処理すると、肺組織における CAT 活性の増加が維持されました。

本研究では、GC/MS を使用した PSO の分析により、ヘキサデカン酸、デカンメチルエステル、スクアレン、ポリデカン、ドコサン、およびその他の誘導体が豊富に含まれていることを示しました。 ヘキサデカン酸およびオクタデカン酸は、抗酸化剤 47、抗がん剤 48、抗アポトーシス剤 49、および抗炎症剤 47 として記録されています。 PSO の活性成分の分析に関する今回の結果は、カボチャ油中に多量の遊離脂肪酸 (オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、ステアリン酸) が含まれていることを報告した他の研究と一致しています 50,51。 さらに、本研究の結果は、カボチャ種子油処理後の酸性誤嚥性肺炎モデルの改善はその組成によるものであると考えた Omar と Sarhan 52 とも一致しています。

スクアレンは親油性イソプレノイドトリテルペンであり、膜脂質の過酸化を防ぐものとしてカボチャ油の抗酸化作用に寄与します53。 スクアレンの酸化は他の脂質よりも早く起こり、脂質の過酸化鎖を切断して過酸化反応をブロックし、細胞膜を安定化および保護すると報告されています54。 さらに、新たな証拠は、グルタチオンペルオキシダーゼ、CAT、SOD、グルタチオン S-トランスフェラーゼの発現と活性化の調節、SOD と CAT の変化の防止、GSH55 の再構成におけるスクアレンの関与を裏付けています。

さらに、PSO は、GSH 結合および GR 活性を触媒する GST 活性を低下させるが、細胞酸化還元状態の必須調節因子である GSH の代謝回転の低下を示す GSH レベルを上昇させることが報告されています 56。 現在のCAT活性の上昇は、MTXに曝露されたラットの肺組織における過酸化水素濃度の増加、および過酸化水素の大量流入の減少におけるPSOの持続性を反映していた。

本研究において、MTXによって誘導されるCATレベルの増加を維持するPSOの能力は、PSOの強力な抗酸化成分によるものであることが示唆され得る。 CAT 活性の上昇は、過酸化水素としてのフリーラジカルの生成の増加を示している可能性があり、肺組織における重要な抗酸化物質の 1 つとしての CAT の役割を裏付けています。 いくつかの報告により、PSO のさまざまな構成成分の効力が確認されました。 Eraslan ら 57 は、カボチャ種子油は、通常の生物学的条件下で生成されるフリーラジカルを除去する可能性があるため、マウスの亜急性アフラトキシン中毒後に肺 SOD、脳 CAT、および肝臓 GSH-Px の活性に生理学的変化を引き起こした可能性があることを示唆しました。 同様に、カボチャ種子油/抽出物/分離物が同じ抗酸化酵素活性を変化させることも報告されています58。 最近、糖尿病マウスを 2% スクアレンで処理すると肝臓カタラーゼとグルタチオンペルオキシダーゼの活性が増加し、600 mg のスクアレンを投与するとカタラーゼとスーパーオキシドジスムターゼの活性が増加し、過酸化水素レベルが低下したことが報告されました 59。

Shaban et al.60は、今回の発見と一致して、ザクロ抽出物の抗酸化活性は、フェノール成分、脂肪酸（プニカ酸や共役α-リノレン酸など）、フィトステロール、トリテルペノイドなどの成分に関連している可能性があると示唆しました。 。 さらに、Habashy ら 61 は、肺組織におけるヴィニフェラ ポリフェノール画分 (VVPF) による抗酸化防御システムの改善が他の研究臓器よりも高いことを発見し、これは VVPF の強力な還元力によるものである可能性を示唆しました。 ABTSラジカルを抑制する能力。 この効力は、バニリン酸、没食子酸、カフェイン酸、p-クマリン酸、シリン酸、フェルラ酸、サリチル酸、エラグ酸などの VVPF のフェノール含有量と、フラボノイドおよびレスベラトロール、および過酸化物、スーパーオキシド、および水酸化ラジカルの除去効率に関連していました 62 。

Omar と Sarhan 52 は、カボチャ油が組織学的および超構造的変化を部分的に弱め、実験的に誘発された酸性吸引性肺炎モデルの肺組織における誘導性 NO シンターゼ免疫発現を減少させることを発見しました。

したがって、PSOがNOレベルの現在の減少を回復できないのは、MTX処置ラットの肺組織におけるNO産生に影響を与えるiNOS発現の低下によるものである可能性がある。 これは、これらの動物におけるニトロソ化ストレスとペルオキシ亜硝酸塩の生成を軽減するのに有益である可能性があります。

本研究では、MTX 注射により肺組織のコリンエステラーゼ (ChE) 活性が顕著に減少しました。 アセチルコリンエステラーゼ (AChE) は、中枢神経系および末梢神経系におけるアセチルコリン (ACh) の加水分解における古典的な役割に加えて、ストレス反応や炎症とも関連していました 63。 AChE の活性低下が肺がんの増殖に寄与する可能性があるため、AChE の異常な発現と構造変化がさまざまな腫瘍で観察されました 64。 一方、AChE はアポトーシスへの関与により腫瘍抑制に関与していることが判明し、アポトーシスおよび腫瘍発生のマーカーおよび調節因子としての潜在的な役割を示しています 65。

MTX 中毒ラットの肺組織における ChE 活性の現在の低下は、肺組織で発生した炎症の状態とその後の ROS 生成によるものである可能性があります。 Tsakiris らの研究 66 では、AChE がフリーラジカルに対して非常に敏感であり、ヒドロキシルラジカルが AChE 阻害に関与していることが明らかになりました。 酵素活性の低下は、腫瘍形成と増殖における酵素の関与による MTX の作用機序にも関連している可能性があります。

パイオニアの報告では、コリン作動系におけるオレイン酸の潜在的な役割が強調され 67 、神経原形質膜に結合した単離されたラット脳シナプトソームによる ACh 産生の増加に関与するコリン アセチルトランスフェラーゼ (ChAT) 様活性が示されました。 さらに、オレイン酸はコリンの取り込みを強化し68、おそらくACh産生を促進するChATの発現に影響を与えることが報告されています69。 さらに、Abed et al.70は、スクアレンとパルミチン酸がAChEに対して異なる阻害率を示すことを報告した。

PSO が MTX 中毒患者の ChE 活性を回復できないことは、2 つのメカニズムによって説明される可能性があります。 第一に、PSO 成分はコリンの取り込みとコリン アセチルトランスフェラーゼ活性を高め、ChE 活性を阻害するため、コリン作動性伝達を促進します。 第二に、ChEの減少は、AChの増加を目的とした代償機構である可能性があります。これは、AChのニューロンまたは非ニューロン源が、α-7ニコチン性ACh受容体を介してマクロファージに局所的に作用することで炎症を軽減し、それによって転写の核移行を減少させる可能性があるためです。因子NF-κB、および炎症誘発性サイトカインTNF-α71のマクロファージ産生。

本研究における TNF-α および IL-6 のレベルの上昇は、MTX が肺組織に対して炎症促進効果があることを示しています。

TNF-α は、慢性炎症性疾患と酸化ストレスの発症に関与する強力な炎症促進性サイトカインです。 その作用は、活性化白血球の成長、増殖、分化、生存率を調節し、他のサイトカインやケモカインの細胞放出を誘導し 72、アポトーシスによる損傷細胞の死を確実にすることによって達成されます 17。 TNF-α のその受容体への結合は、シグナル伝達カスケードを引き起こし、伝播させ、NF-κB を活性化する局所的または全身性の炎症の発症につながり、炎症プロセスを強化する正のフィードバック機構を形成します 17,72。

IL-6 は、炎症促進性と抗炎症性の両方の特性を持つ多面発現性サイトカインです。 これはさまざまな免疫細胞によって産生され、TNF-α および IL-1 と相乗して全身性炎症反応を促進します 73。

研究では、急性 MTX 誘発肺毒性における TNF-α、インターロイキン-1 (IL-1)、インターロイキン-8 (IL-8)、および単球走化性タンパク質-1 の増加が報告されています 74,75。 Kurt ら 76 は、高レベルの TNF-α、MDA、ミエロペルオキシダーゼ (抗酸化防御システムの構成要素)、および内皮組織-1 (強力な血管収縮剤) が、MTX 中毒ラットの肺における組織マクロファージ浸潤の阻害に起因すると考えています。それはインターロイキンの合成に影響を与えます。 TNF-α と IL-6 の両方の現在の増加は、MTX 誘発毒性におけるこれらのサイトカインの炎症誘発性の役割を裏付けています。

炎症誘発性サイトカインに対する MTX の作用は、NF-κB によって媒介されることが示唆されています。 本研究における MTX 注射は、炎症を起こした肺切片において NF-κB の強い陽性発現を示しました。 NF-κB の活性化は、iNOS の発現、炎症、細胞増殖、免疫応答、アポトーシスの開始に関与するカスケードを引き起こす可能性があります 77。 これは、炎症誘発性サイトカイン (TNF-α または IL-1β) として多くの刺激によって活性化されます 78。 したがって、現在のNF-κBの発現増加は、MTX注射によるラット肺組織におけるTNF-αおよびIL-6の活性化によって媒介される可能性がある。

今回の結果は、PSO が MTX 毒性を克服するメカニズムの 1 つとして、炎症誘発性サイトカインの阻害を強調しました。

カボチャ油には、抗炎症効果のあるポリフェノールやその他の生理活性植物化学物質が含まれていることが報告されています79。 Lai et al.80は、カボチャ油および酸吸引群の肺におけるカボチャ油投与後の炎症性細胞浸潤の減少およびコラーゲン線維の面積パーセントは、カボチャ油中の不飽和遊離脂肪酸成分によるものであることを示した。

Al-Okbi et al.17 は、PSO の生物活性は全脂肪酸の 3 分の 1 を占めるリノール酸によるものであると考えました。 オメガ 3 脂肪酸は、脂質メディエーターの合成、サイトカインの放出を調節し、白血球と内皮細胞を活性化することで、体の過剰な炎症反応を調節して肺の炎症を軽減します 47,81。

血管内皮増殖因子（VEGF）レベルに関する本研究の結果は、MTX治療群のラット肺組織におけるVEGFレベルの有意な上昇を示した。

肺における VEGF の主な供給源は、VEGF を発現する平滑筋細胞、マクロファージ、および内皮細胞に加えて、肺胞上皮です。 高レベルの VEGF は成人期の肺に持続し 82、正常な肺の維持および急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) の病因における VEGF の役割を示唆しています 83。

したがって、本研究における MTX 後の肺 VEGF レベルの増加は、TNF-α と IL-6 が関節リウマチ (RA) における VEGF 産生を上方制御することが報告されているため、サイトカイン産生の増加に二次的なものである可能性があります 84。

オメガ 3 脂肪酸の適用により、炎症反応を悪化させるロイコトリエン B4 がロイコトリエン B5 シリーズ（活性が低い）に変換され、肺組織の炎症反応が急速に軽減され、その結果、肺水腫が軽減され、肺血管透過性が改善されたことが報告されています85。 。 Huangら86は、オメガ3酸は急性肺損傷（ALI）患者の呼吸機能と呼吸状態を改善できると結論付け、オメガ3脂肪酸がALI治療における効果的かつ安全な戦略となる可能性があることを示唆した。 PSO 治療後の VEGF レベルの現在の回復は、PSO 構成成分の強力な抗炎症特性に起因すると考えられます。

アポトーシスは、化学的に誘発された毒性の際に発生する重要かつ重要なプロセスです。 本研究は、免疫組織化学的分析により、間質組織、肺胞および気管支の内層上皮およびMTX群の細気管支におけるアポトーシスマーカーカスパーゼ-3の顕著な強い陽性発現を示した。 カスパーゼ-3 はアポトーシスのプロセスにおける重要な要素であり、細胞死の誘導のシグナルを送ります 79。 カスパーゼ-3 は、アポトーシスの貴重なマーカーと考えられていました 87。 これは、MTX 中毒ラットで検出された重度の肺損傷を説明できる可能性があります。

この発見は、カスパーゼ-3 発現が高い MTX グループに同様の組織学的損傷を発見した Kurt ら 76 の結果と一致しています。 著者らは、これらの変化は過剰なサイトカインレベル、内皮-1分泌、ROS形成によるものであり、これらがカスパーゼ-3経路を活性化して肺損傷を引き起こすと考えた。 ROS および正確なプロテアーゼによるタンパク質分解に対する感受性の増加による、ペプチド鎖の崩壊、タンパク質の架橋による電荷修飾、および特定のアミノ酸の酸化が、細胞内で検出されるカスパーゼ-3 および NF-κB の強い陽性発現の根底にある可能性があります。本研究における免疫組織化学的分析は、MTXグループの肺間質組織、肺胞、気管支の内層上皮および細気管支におけるものである。

本研究では、PSOは、炎症とアポトーシスを軽減することによって保護効果を生み出し、それによってMTX誘発性の肺損傷を軽減および軽減した。これは、炎症性細胞の数が少なく、軽度の浮腫および出血が認められた肺組織の顕著な保護を示した組織病理学的検査で明らかである。 MTX + PSO グループ内。 免疫組織化学的手法を使用すると、PSO は、MTX を注射したラットの肺組織におけるキャスペース 3 の発現を減少させることによって抗アポトーシス効果を発揮することも示されました。

本研究の結果によれば、MTX の単回注射は、ROS、炎症誘発性サイトカイン、転写因子 (NF-κ) の増加を介して肺毒性を誘発すると結論付けることができます。 これらの変化は、最終的にアポトーシスと重度の肺損傷を引き起こします。 本研究の新たな発見は、PSO 後の細胞毒性、したがって MTX 誘発肺損傷の減少でした。 PSO の経口投与は、その成分の強力な抗酸化作用、抗炎症作用、抗アポトーシス作用によって、MTX によって誘発される変化のほとんどを改善しました。 生化学的所見は、PSO後の肺組織の顕著な保護を示す組織学的検査と一致した。 本研究の限界は、単回用量の MTX の使用と短い実験期間でした。

したがって、MTX を化学療法や RA およびその他の疾患の治療に使用する際、特に肺疾患を患っている患者においては、MTX の肺毒性を考慮する必要があります。 MTX 治療を受けている患者は、肺が MTX 治療の影響を受けていないか定期的に監視する必要があります。 化学療法中の患者には、天然の抗酸化剤および抗炎症剤の使用も強く推奨されます。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。 この研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

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科学技術イノベーション資金庁 (STDF) がエジプト知識銀行 (EKB) と協力して提供するオープンアクセス資金。 この研究はカイロ大学の研究資金によって支援されました。

カイロ大学理学部動物学科（エジプト、ギザ）

アヤ・M・アボスレア、ヘバ・S・アブル・エズ、サハル・M・マフムード、ナワル・A・アーメド

カイロ大学獣医学部病理学教室（エジプト、ギザ）

モハメド・R・ムーサ

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著者全員が研究の構想と設計に貢献しました。 材料の準備、データ収集、生化学分析は AMA、HSAE、SMM によって実施されました。 組織学的研究および免疫組織化学的研究は MRM によって実施されました。 原稿の初稿は AMA によって書かれ、すべての著者が原稿の以前のバージョンにコメントしました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。 最終的な改訂と承認は NAA によって行われ、著者は出版に同意します。

Heba S. Aboul Ezz への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

アボスレア、AM、アブール・エズ、HS、マフムード、SM 他メトトレキサート誘発性肺毒性に対するカボチャ種子油の潜在的な役割。 Sci Rep 13、7321 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34143-6

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受信日: 2022 年 7 月 15 日

受理日: 2023 年 4 月 25 日

公開日: 2023 年 5 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34143-6

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