SIRPα抗体と腫瘍溶解性ウイルスOH2の組み合わせは、自然免疫を活性化し、腫瘍免疫微小環境を再プログラムすることにより腫瘍を防御します

BMC Medicine volume 20、記事番号: 376 (2022) この記事を引用

2750 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

腫瘍溶解性ウイルス（OV）と免疫チェックポイント阻害との組み合わせは研究のホットスポットであり、良好な有効性が示されています。 ここでは、抗腫瘍治療として腫瘍溶解性単純ヘルペス ウイルス 2 (OH2) と抗 SIRPα 抗体を組み合わせる最初の試みを紹介します。 私たちの結果は、自然免疫と OV の組み合わせに関する独自の洞察を提供します。

我々は、RAW264.7 細胞における OH2 の分極と活性化を in vitro で検証しました。 続いて、担癌マウスモデルにおける OH2 と抗 SIRPα の併用療法の抗腫瘍能力を評価しました。 RNA-seq および Single-cell RNA-seq を使用して、腫瘍微小環境の変化を特徴付けました。

OH2 ライセートは、RAW264.7 細胞を効果的に刺激して、M2 表現型ではなく M1 表現型に分極させ、in vitro で M1 表現型の機能を活性化しました。 マクロファージクリアランス実験では、OH2 療法が M1 マクロファージの極性化を誘導し、腫瘍担持マウスモデルにおける抗腫瘍免疫応答に関与しました。 OH2 と抗 SIRPα の組み合わせによる治療は、腫瘍の増殖を効果的に阻害し、マウスの生存期間を大幅に延長しました。この結果は、治療開始時の腫瘍体積が大きいマウス モデルでより顕著でした。 これらの結果は、併用療法が TME をより深く再形成し、より強力な自然免疫応答と適応免疫応答を活性化できることを示唆しています。

私たちのデータは、抗 SIRPα 抗体と組み合わせた腫瘍溶解性ウイルス療法の実現可能性を裏付けており、腫瘍溶解性ウイルス療法の新しい戦略を示唆しています。

査読レポート

がん治療におけるウイルスの使用は 1 世紀以上前に始まりました。 遺伝子工学の発展とウイルスの作用機序の理解の進歩により、腫瘍溶解性ウイルス (OV) が理想的な治療プラットフォームになる可能性があります。 腫瘍細胞に対する OV の殺傷効果は、直接的な細胞溶解活性によるものだけではなく、複数の機構を組み合わせた複雑な制御モードも関与していることを示す研究の数が増えています [1]。 これらのメカニズムには、腫瘍の微小環境およびマクロ環境の変化の調節、CD8+ T 細胞によって媒介される特異的免疫応答、および自然免疫細胞性免疫応答が含まれます [2、3、4]。 治療活性には複数の機構があるにもかかわらず、多くの前臨床および臨床研究では、ほとんどの腫瘍溶解性ウイルスは、武装か非武装かにかかわらず、単剤療法としての有効性が限られていることが示されています[5、6]。 腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍微小環境（TME）を改変し、免疫学的に「コールド」腫瘍を変化させる能力は、腫瘍溶解性ウイルスと免疫療法や化学療法などの他の治療法を組み合わせることで、より良い治療結果が得られる可能性があることを示唆しています[7、8]。

現在、OV と免疫チェックポイント阻害 (ICB) の組み合わせが研究のホットスポットとなっており、いくつかの臨床試験で良好な効果が示されています [9]。 しかし、OV と免疫療法の組み合わせは主に T 細胞の制御に焦点を当てており、自然免疫に対するその効果に関する研究はほとんどありません。 OV は細胞溶解中に免疫原性細胞死 (ICD) を促進し、それによって損傷関連分子パターン (DAMP) や病原体関連分子パターン (PAMP) の放出を通じてマクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞を動員して活性化し、さらに免疫原性細胞死を促進します。 TME における腫瘍特異的 T 細胞の活性化 [4、10]。 したがって、骨髄細胞を活性化して腫瘍の死滅を活性化し、抗原提示を強化して内因性免疫機能を活性化することにより、抗腫瘍療法に独自の洞察が得られると期待されています。

マクロファージは、さまざまな機能を持つ可塑性の高い免疫細胞の一種であり、通常、極性状態に基づいて古典的に活性化された M1 マクロファージと M2 マクロファージに分類されます [11]。 M1 マクロファージは、炎症性サイトカインの放出を通じて炎症性 Th1 応答を促進し、抗原提示および共刺激分子の発現の上方制御を通じて T 細胞応答をさらに強化します [11、12]。 したがって、M1 マクロファージは腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫に関与している可能性があります。 M2 マクロファージは一般に内因性抗腫瘍免疫の阻害に関連しています。 M2 マクロファージの数を減らし、M1 マクロファージの数を増やすことは、腫瘍治療を成功させるための重要な前提条件です。 さらに、マクロファージの食作用機能は、CD47-SIRPα 抗食作用軸によって調節されています[13]。 CD47 は、腫瘍細胞上での高発現によりマクロファージの食作用を阻害します [13、14]。 CD47-SIRPα 軸の抗食作用は抗体によってブロックされるため、マクロファージの食作用が増加します。 最近の研究では、マクロファージ上の SIRPα をブロックすると、マクロファージの抗腫瘍能力を効果的に活性化できることが示されました [15]。

以前の研究 [16、17] では、腫瘍溶解性単純ヘルペス ウイルス 2 (OH2) による治療がマウスの TME を効果的に変化させ、抗腫瘍免疫応答を誘導できることを発見しました。 この研究では、マウス腫瘍モデルを OH2 と抗 SIRPα 抗体の組み合わせで治療しました。 併用療法の治療効果と免疫活性化状態を解析した。 私たちの結果は、マクロファージの活性化と組み合わせたOH2が有望な抗腫瘍療法であることを示唆しています。

CT26、MC38、4T-1、および RAW264.7 細胞株は、National Infrastructure of Cell Line Resource (北京、中国) から購入し、私たちの研究室で保管しました。 細胞は、5% CO2を含む37℃の恒温インキュベーター内で培養されました。

OH2 は Binhui Biopharmaceutical Co., Ltd. (中国、武漢) から提供されました。 このウイルスは、ICP47 遺伝子と ICP34.5 遺伝子を欠失した野生型 HSV-2 株 HG52 に由来する弱毒化 OH2 でした [18、19]。

対数増殖期の CT26、MC38、および 4T-1 細胞株を、細胞が 70 ～ 80% コンフルエンスに達した時点で 10 cm2 培養皿に継代し、細胞を PBS ですすぎ、その後 5 ml の無血清 RPMI-1640 培地を添加しました。 (HyClone、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用し、MOI=1 に従って細胞を OH2 で感染させ、1 時間後に 10% FBS を含む RPMI1640 培地 (Gibco、マサチューセッツ州ウォルサム) 5 ml を添加します。 30 時間後、細胞上清を回収し、4℃、400 g で 5 分間遠心分離し、溶解物を回収して、後で使用するために -80℃ で保存しました。 CT26、4T-1、MC38、および未処理の RAW264.7 の無細胞上清 (CFS) をコントロールとして使用しました。 CT26、4T-1、およびMC38のCFSは、対数増殖期の細胞の培養上清から4℃、400gで5分間遠心分離して得た。 凍結融解を繰り返して調製したCT26、MC38、および4T1細胞溶解物の上清も対照群として使用した。

対数増殖期の RAW264.7 細胞を 96 ウェル プレートに 2000 細胞/ウェルで播種し、6 時間以上培養しました。 細胞が接着した後、ライセートとコントロールを細胞に添加し、対応する時点 (0 時間、6 時間、12 時間、24 時間、48 時間) で Cell Counting Kit-8 (CCK8) 検出を実行しました (同仁堂、熊本県）。 検出前に、100 μl の検出作業溶液 (CCK8 試薬: RPMI1640 培地 = 1:10) を各ウェルに添加し、暗所、37℃、5% CO2 インキュベーター内で 1 時間インキュベートしました。 最後に、マイクロプレートリーダー (Bio-Rad、日本) を使用して、450 nm の波長で細胞の吸光度を検出しました。

対数増殖期のRAW264.7細胞を6ウェルプレートに106細胞/ウェルで播種した。 少なくとも 6 時間後、細胞は壁に完全に付着し、ライセートとコントロールを別々に添加しました。 24 時間の処理後、RAW264.7 細胞を FITC 抗マウス F4/80 (クローン: FJK-16s、Invitrogen、ウォルサム、マサチューセッツ州)、APC 抗マウス CD86 (クローン: GL-1、Biolegend、サンディエゴ) で染色しました。 、カリフォルニア州）およびPE抗マウスCD206（クローン：MR6F3、Invitrogen、Waltham、Massachusetts）を抗体のプロトコールに従って（M1マクロファージ：F4/80+CD86+、M2マクロファージ：F4/80+CD206+）、フローに供した。サイトメトリー (LSR II、BD)。 マウスの脾臓マクロファージ上の SIRPα の検出には、FITC 抗マウス F4/80、APC 抗マウス CD11b (クローン: M1/70、Biolegend、カリフォルニア州サンディエゴ)、および PE 抗マウス SIRPα (クローン: P84、Biolegend) を使用しました。 、カリフォルニア州サンディエゴ）。 この研究でマクロファージのタイピングを検出するために使用したすべてのフローサイトメトリーは、抗体アイソタイプ対照グループ（PE Rat IgG2a、クローン: RTK2758、Biolegend、米国、APC Rat IgG2a、クローン: RTK2758、Biolegend、米国、FITC Rat IgG2a、クローン）を使用して設定されました。 ：RTK2758、バイオレジェンド、米国）。

対数増殖期の CT26、MC38、および 4T-1 細胞株を消化し、1×106/mL の濃度で再懸濁しました。 CFSE (C34554、Life Technology、マサチューセッツ州ウォルサム) 作業溶液 (0.5 mM) 1 μL を腫瘍細胞 2 ml ごとに 1 × 106/mL の濃度で添加し、37°C​​ (5% CO2) で 8 分間インキュベートしました。分。 インキュベーション後、10% FBSを含む予冷したRPMI 1640培地10mlを加えて染色を停止した。 遠心分離により上清を除去し、10% FBSを含むRPMI 1640培地で細胞濃度を5×105/mLに調整した。 溶解物および対照で処理したraw264.7の濃度を5×106/mLに調整した。 エフェクター対ターゲット比率として 25:1、50:1、および 100:1 の比率の平行サンプルを使用して、96 ウェル U 字型ウェル プレート、100 μL の raw264.7 細胞、および 100 μL で共培養を実行しました。腫瘍細胞を各ウェルに添加し、3 つの並行サンプルをセットアップしました。 次に、培養プレートを 37°C (5% CO2) に 4 時間置きました。 試験前に、200 μL の PI (P8080、Solarbio、北京、中国) 作業溶液 (2.5 μg/mL) を各培養ウェルに添加しました。

マウスの脾臓の CT26、MC38、および 4T-1 細胞株とマクロファージを、APC 抗マウス CD47 (クローン: miap301、Biolegend、カリフォルニア州サンディエゴ)、精製抗マウス SIRPα (クローン: P84、Biolegend) で染色しました。 、サンディエゴ、カリフォルニア州）および抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（ａｂ１５０１１３、アブカム、ケンブリッジ、英国）抗体を、抗体のプロトコールに従って使用した。 CD47およびSIRPαの発現レベルはフローサイトメトリーによって検出されました。

パラフィン包埋組織切片を 60 ～ 65°C で 6 時間以上焼き、熱いうちにキシレンに入れて脱蝋しました。 ステップの後に、勾配エタノール水和、クエン酸修復抗原 (ZLI 9064、Zsjqbio、北京、中国)、3% 過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ活性のブロック、ブロッキング (SP-KIT-B2、MXB、福建省、中国)、一次抗体 F480 (クローン: SP115、希釈: 1:200、Abcam、ケンブリッジ、英国)、CD86 (クローン: E5 W6H、希釈: 1:500、CST、ダンバーズ、マサチューセッツ)、CD206 (ポリクローナル、希釈: 1:100、Abcam、ケンブリッジ) 、英国）、CD8（ポリクローナル、希釈：1:200、Affinity Biosciences、江蘇省、中国）、CD16（ポリクローナル、希釈：1:200、Affinity Biosciences、江蘇省、中国）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体（ Kit-5010、MXB、福建省、中国）インキュベーション、3,30-ジアミノベンジジン DAB（DAB-1031、MXB、福建省、中国）色原体で可視化、ヘマトキシリン染色（Solarbio、北京、中国）、塩酸エタノール分化、およびアンモニア水は青色に戻ります。 最後に、勾配エタノールで脱水した後、組織切片をキシレンで脱水し、中性ガムで密封しました。 乾燥後、組織切片の染色を顕微鏡（Nikon Eclip se 80i、日本）で観察した。

パラフィン包埋組織切片を 60°C ～ 65°C で 6 時間以上焼き、熱いうちにキシレンに入れて脱蝋しました。 勾配エタノール水和および中性ホルマリン浸漬後、各染色抗体をクエン酸塩で順次修復し、ヤギ血清でブロックし、F480 (クローン: SP115、希釈: 1:500、Abcam、ケンブリッジ、英国)、CD86 に対する一次抗体とインキュベートしました (クローン: E5 W6H、希釈: 1:1000、CST、Danvers、マサチューセッツ州)、CD206 (ポリクローナル、希釈: 1:200、Abcam、ケンブリッジ、英国)、CD8 (ポリクローナル、希釈: 1:500、Affinity Biosciences、江蘇省、中国）、CD16（ポリクローナル、希釈：1:500、Affinity Biosciences、江蘇省、中国）および二次抗体を使用し、蛍光染色してシグナルを増幅します。 染色が完了した後、DAPI 作業溶液を滴下し、最後に、キット (TSA-RM、PANOVUE、北京、中国) の指示に従って、超抗消光マウント タブレットをマウントに追加しました。 染色された組織切片をスキャンし、Plaris および Inform ソフトウェアで分析しました。

IHC 画像は CaseViewer2.4 ソフトウェアを使用してスキャンされました。 染色の程度をスコア化しました。染色が 10% 未満の細胞は陰性染色 (-、1) としてスコア付けされ、染色が 10 ～ 49% の細胞は (+、2) としてスコア付けされました。 染色率 50 ～ 74% の細胞は (++, 3) としてスコア付けされ、75 ～ 100% 染色された細胞は (+++, 4) として示されました。 染色陽性範囲スコアは次のとおりです: 無色 (0)。 淡黄色の粒子 (1)、黄褐色の粒子 (2)、および茶色の粒子 (3)。 最終スコアは、染色範囲スコアに染色陽性範囲スコアを乗じたものとして定義されました[20]。 陰性発現スコアは 0 ～ 5 の範囲であり、陽性発現スコアは 5 を超えていました [21]。

マウスは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (北京バイタルリバー実験動物技術有限公司) から購入しました。 体重約 19 ～ 20 g の生後 6 ～ 8 週齢のメスの Balb/c マウスを、動物室の層流ウルトラクリーン ラック内で特定の無菌条件下で約 1 週間保管しました。 各マウスの背部右側に３×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種した。 腫瘍は約 5 ～ 7 日で出現し、腫瘍の直径が 3 ～ 5 mm または 8 ～ 10 mm に成長したときに治療が行われました。

すべての操作は、国が指定する特定病原菌除去（SPF）実験用マウス飼育管理システムの標準操作手順に従って実施されました。 すべての動物関連の実験手順は、国立がんセンター/がん病院、中国医学アカデミー (CAMS)、および北京連合医科大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。

CT26細胞皮下移植腫瘍モデルを構築した。 腫瘍の直径が 3 ～ 5 mm に達したとき (7 日目)、CL モデルのマウスを 3 つのグループ (OH2 [OH2 + コントロール リポソーム]、OH2 + CL、および PBS コントロール グループ) に分けました。腫瘍の体積。 各グループに 10 匹以上のマウスを割り当てました。 ＯＨ２（２×１０６プラーク形成単位［ＰＦＵ］）を、０日目、２日目、および４日目に１００μｌの量で腫瘍内注射（ｉｔ）によって行った。 マウスあたり 100 マイクロリットルの CL (7 mg/mL、F70101C-NC、FormuMax、カリフォルニア州サニーベール) または対照リポソーム (7 mg/mL、F70101-N、FormuMax、カリフォルニア州サニーベール) を腹腔内注射 (ip) によって投与しました。 OH2処理の前日に。 PBS対照群にはマウス1匹あたり100μLのPBSを与えた。 腫瘍の増殖を定期的に観察し、マウスの各グループについて記録した。 14 日間の治療後、免疫組織化学的および多色免疫組織化学的染色のために腫瘍組織を切除しました。 生存観察グループのマウスは、40日目に再び腫瘍を抱えていました。

CT26細胞皮下移植腫瘍モデルを構築した。 腫瘍の直径が 3 ～ 5 mm に達したとき (7 日目)、初期治療時に腫瘍が小さくなったと定義されました。 初回治療時に腫瘍が小さい抗SIRPαモデルのマウスを6つのグループ（OH2+抗SIRPα抗体グループ、OH2+アイソタイプグループ、OH2グループ、抗SIRPα抗体グループ、アイソタイプグループ、PBSコントロールグループ）に分けた。腫瘍体積が均一に分布しています。 各グループに 10 匹以上のマウスを割り当てました。 OH2 治療または PBS を 0 日目、2 日目、および 4 日目に注射し、抗 SIRPα 抗体 (クローン: P84、Bioxcell、レバノン、ニューハンプシャー) またはアイソタイプ (TNP6A7、Bioxcell、レバノン、ニューハンプシャー) を投与しました。抗SIRPα抗体およびアイソタイプを100μg腹腔内(ip)注射し、保存液を含まないPBSで1mg/mlに希釈し、各マウスに100μLを腹腔内注射した。 PBS対照群にはマウス1匹あたり100μLのPBSを与えた。 OH2の投与方法、投与量はCLモデルと同様とした。 マウスの腫瘍増殖を 2 日ごとに定期的に観察し、記録しました。

腫瘍の直径が 8 ～ 10 mm に達したとき (14 日目)、それは最初の治療時に腫瘍が大きかったと定義されました。 初回治療時に腫瘍が大きかった抗 SIRPα モデルのマウスを、均等に分布する 4 つのグループ（OH2+ 抗 SIRPα 抗体グループ、OH2+ アイソタイプ グループ、OH2 グループ、抗 SIRPα 抗体グループ、および PBS コントロール グループ）に分けました。腫瘍の体積。 各グループに 10 匹以上のマウスを割り当てました。 投与方法および治療戦略は上記と同じであった。 マウスの腫瘍の成長を定期的に観察し、記録しました。 12 日間の治療後、免疫組織化学、多色免疫組織化学染色、および RNA 配列決定のために腫瘍組織が切除されました。

マウスのサイズが 2500 mm3 に達したとき、または腫瘍の転移や急速な成長により潰瘍形成、壊死、または感染を引き起こし、食事や歩行に支障をきたしたときなど、実験のエンドポイントまたは人道的エンドポイントに到達したとき、マウスは 5% 抱水クロラールで麻酔されました。そして頚椎脱臼により死亡。 腫瘍体積の計算式は体積＝（長さ×幅２）／２とした。

この研究に関係するトランスクリプトーム配列決定は、天津Nuohe Zhiyuan Bioinformation Technology Co., Ltd.によって実施され、完了しました。RNAサンプルは、総量が30μL以上、総量が1.5μg以上、濃度が50μg以上に達する必要がありました。 ng/μL。 アガロースゲル電気泳動定量法、Nanodrop、および Agilent 2100 を使用して、提出された RNA の濃度、純度、完全性をテストしました。 ライブラリー構築のタイプは、真核生物の鎖に特異的なライブラリーでした。 シーケンス戦略は Illumina Hiseq-PE150 (双方向シーケンス) でした。

対照群、OH2 群、および併用治療群の腫瘍組織を単一細胞配列決定分析に供し、この研究で使用した単一細胞配列決定技術は Huada Company から提供されました。 腫瘍解離キット (マウス、MACS) を使用して組織を解離し、死細胞を除去し、生細胞の単一細胞懸濁液を配列決定のために残しました。 得られたデータは Seurat パッケージを使用して分析され、火山プロットは R ソフトウェア パッケージ EnhancedVolcano を使用して描画されました。 GO 分析と KEGG 分析に使用される R パッケージには、tidyverse、patchwork、monocle、clusterProfiler、org.Mm.eg.db が含まれていました。

トランスクリプトーム配列データの解析には R ソフトウェア バージョン 4.0.2 を使用し、グループ間の差次的発現解析には R ソフトウェア パッケージ「edgeR」を使用しました。 遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) を使用して、異なるグループ間のシグナル経路の違いを研究しました。 R ソフトウェア パッケージ「clusterProfiler」は、Gene Ontology (GO) および京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) の解析に使用されました。 遺伝子セット変異解析 (GSVA) を免疫細胞浸潤解析に使用しました。 スチューデントの t 検定を使用して差次的に発現した遺伝子を比較し、P 値を Benjamini-Hochberg 法によって調整および補正しました。 log2 倍変化は 1 より大きく、補正された P 値は差の有意性を判断するためのしきい値として 0.01 未満でした。 nCounter Mouse PanCancer 免疫プロファイリング パネル (NanoString) から作成された合計 770 個の免疫関連マウス遺伝子が、追加ファイル 1: 表 S1 および追加ファイル 2: 表 S2 にリストされている参照遺伝子として使用されました。

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン８を統計分析に使用し、統計的有意差をｐ値＜０．０５として定義した。 両側対応のないスチューデントの t 検定を使用して 2 つのグループを比較しました。 2 つ以上のグループの腫瘍体積の実験データに対して二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。 生存曲線データには、カプランマイヤー法とログランク検定が使用されました。 生存期間は、治療の開始から観察の終了までの時間として定義されました。 結果は平均値±SEMとして表されます。この研究では、特に明記した部分を除き、すべての実験を少なくとも3回繰り返しました。

図1Aに示すように、結腸がんのOH2治療過程におけるマクロファージの役割を確認しました。 図1Bに示すように、ライセートで処理したRAW264.7細胞は、CCK8アッセイにより生存率と増殖能力が大幅に向上しました（CT26およびMC38細胞ではp<0.0001、無細胞上清と比較してp=0.001およびp<0.0001） (CFS)、未処理の RAW264.7 細胞および 4T-1 細胞)。 溶解物はマクロファージの活性化を刺激しました。 また、OH が CCK8 を介してマクロファージを直接活性化できるかどうかを決定するために、OH2 を異なる MOI (MOI = 1、MOI = 0.5) で RAW264.7 細胞とインキュベートしました。 予想通り、OH2 (追加ファイル 3: 図 S1) または凍結細胞溶解物 (追加ファイル 3: 図 S2) を添加しても、24 時間以内にマクロファージを直接活性化することはできませんでした。

OH2 ライセートは、in vitro で RAW264.7 極性化と食作用を誘導します。 ライセート調製の概略図と研究で実行された実験のフローチャート。 B ライセート (赤)、CFS (青)、および未処理 (黒) で処理した CT26 (左)、MC38 (中央)、および 4T-1 (右) 細胞株の 24 時間の CCK8 アッセイによる細胞増殖アッセイの結果。 C ライセートまたは CFS 処理による各細胞株からの 1 つの代表的なサンプルのフローサイトメトリー分析の結果。 D フローサイトメトリーによって検出された、ライセート、CFS、および CT26、MC38、および 4T-1 細胞の未処理グループにおける M1 (F4/80+CD86+) サブタイプの割合。 データは、治療グループあたり 3 つのサンプルからの平均です。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して 2 つのグループ間の差異の有意性を分析し、ANOVA を使用してグループ間の差異 (>2) の差異の有意性を分析しました。 E フローサイトメトリーによって検出された、ライセート、CFS、および CT26、MC38、および 4T-1 細胞の未処理グループにおける M2 (F4/80+CD206+) サブタイプの比率。 データは、治療グループあたり 3 つのサンプルからの平均です。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、グループ間の差異の有意性を分析しました。 F. CFSE/PIによって検出された、さまざまな癌細胞溶解物で処理されたマクロファージの食作用および殺傷機能。 各細胞株に対して 3 つのエフェクターと標的の比率を設定しました (RAW264.7: 腫瘍細胞 = 25:1、50:1、および 100:1)。 データは、治療グループあたり 3 つのサンプルからの平均です。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001

続いて、フローサイトメトリーを使用して、ライセート処理後の M1 (F4/80+CD86+) マクロファージと M2 (F4/80+CD206+) マクロファージの比率を検出しました (図 1C)。 ライセートおよび CFS 処理後の M1 マクロファージの割合は有意に増加しました (CT26、MC38、および 4T-1 ライセート処理ではそれぞれ p=0.0015、p<0.0001、および p<0.0001、p=0.01、p=0.0073、および p=未治療群と比較して、CT26、MC38、および4T-1 CFS治療ではそれぞれ0.023でした（図1D）。 ライセートと CFS 処理の間にも有意差がありました (CT26、MC38、および 4T-1 ライセート処理についてそれぞれ p=0.01、p=0.0018、および p<0.0001)。 興味深いことに、ライセート群と未処理群の間で M2 マクロファージの割合に差はありませんでしたが、CFS 内の M2 マクロファージの割合は他の 2 つのグループと比較して大幅に増加しました (図 1E、追加ファイル 3:図 S3)。 ）。 ブロックされたSIRPαグループとブロックされていないSIRPαグループのライセートで処理されたRAW264.7細胞におけるM1（F4/80+CD86+）およびM2（F4/80+CD206+）マクロファージの比率は有意な差はありませんでした（p=0.010、追加ファイル） 3：図S4）。 凍結細胞ライセートとCFSによって誘導されたRAW264.7分極の差は統計的に有意ではありませんでした（追加ファイル3：図S5）。 同様の結果がマウス脾臓初代マクロファージでも観察されました。 CFSはM1またはM2の割合を有意に変化させなかったが、初代マクロファージにおけるM1とM2の両方の割合は溶解物処理後に有意に増加した(p<0.0001)。 凍結細胞溶解物も M1 の割合を増加させましたが、それは M2 の割合により多く反映されました (追加ファイル 3: 図 S6)。 これらの結果は、溶解物がマクロファージを効果的に刺激して、M2 表現型ではなく M1 表現型に分極することを示しました。 マクロファージの極性化と食作用との関係を解明するために、細胞死滅アッセイを実施しました。 CFS群と未治療群の間に有意差はなかった。 ライセート極性 M1 マクロファージは、他の 2 つのグループと比較して有意な殺傷効果を有し、その効果はエフェクター細胞：標的細胞比 (E:T) の増加とともに増強されました (図 1F)。

極性化に伴うマクロファージの変化を調べるために、異なる RAW264.7 治療グループに対して RNA シーケンスを実行しました。 CT26 ライセートを上清または未処理の RAW264.7 細胞と比較した場合でも、GO 分析により、ライセートが RAW264.7 細胞の抗ウイルス シグナル伝達経路の活性化 (ウイルスへの応答、ウイルス プロセスの制御、自然免疫応答の制御、およびインターフェロンベータに対する反応 (図 2A および B)。 KEGG 分析では、ライセート処理と同じシグナル伝達の変化が示されました (図 2C および D)。 さらに、GSEAは、ライセート処理後にインターフェロン関連経路が上方制御され、細胞増殖関連シグナル伝達経路が下方制御されることを示しました（図2E）。 上清グループと比較して、ライセート中の M1 マーカー (Il23a、Il6、Nfkb1、Cd80、Il27、Ccl5、Cd86、Il21r、Il33、Ccl6、Cxcl10、Il7、Cxcl11、Il18、Ccl7、Tlr4、および Ccl2) の発現治療群では上方制御され、M2 マーカー (Stat3、Mr1、および Ncan) の発現は下方制御されました (図 2F および G)。 これらの結果は、ライセート処理が M1 マクロファージの極性化を効果的に誘導し、M1 マクロファージの機能を活性化し、抗ウイルスおよび抗腫瘍免疫応答を活性化できることを示唆しました。

ライセート処理グループ、CFS 処理グループ、および未処理グループの RNA シーケンスにより、Raw264.7 の機能が特徴付けられました。 ライセートとCFSで処理したRAW264.7細胞の差次的に発現した遺伝子のGO分析。 B ライセートで処理した RAW264.7 細胞と未処理の RAW264.7 細胞の差次的に発現した遺伝子の GO 分析。 C ライセートおよびCFSで処理したRAW264.7細胞の差次的に発現した遺伝子のKEGG分析。 D ライセートで処理した RAW264.7 細胞と未処理の RAW264.7 細胞の差次的に発現した遺伝子の KEGG 分析。 E ライセートおよび CFS で処理した RAW264.7 細胞の差次的に発現した遺伝子の GSEA。 F ライセートおよび CFS で処理した RAW264.7 細胞における M1 マクロファージ マーカーの発現。 G ライセートおよび CFS で処理した RAW264.7 細胞における M2 マクロファージ マーカーの発現。 色はRNAシーケンスにおける遺伝子の発現レベルの値を表します

図 3A に示すように、我々は OH2 処理と in vivo でのマクロファージ機能の間の相関関係を調査しました。 以前の研究[16]に基づいて、我々はOH2療法が適応免疫細胞（T細胞）と自然免疫細胞（マクロファージ、DC、NK細胞）の浸潤を促進することを示しました（図3B）。

OH2 処理は、in vivo での腫瘍死滅のためにマクロファージを M1 表現型に極性化しました。 A CL動物モデルの治療プロセスと実験スケジュール。 B GSVAによるOH2処理群と対照群の免疫細胞浸潤解析結果。 C OH2 併用 CL グループ (赤)、OH2 (OH2 とコントロール リポソーム) グループ (青)、およびコントロール グループ (黒) の腫瘍増殖曲線。 赤いボックス (右) を拡大して、CL グループと OH2 グループを組み合わせた OH2 を示します。 実験データに対して二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。 n=10 マウス/グループ、****、P<0.0001。 D OH2 を組み合わせた CL グループ (赤)、OH2 グループ (青)、およびコントロール グループ (黒) の生存曲線。 生存曲線データには、カプランマイヤー法およびログランク検定を使用した。 ns、大きな違いはありません。 E OH2 グループ (左) と OH2 を組み合わせた CL グループ (右) の代表的な M-IHC 結果。 F4/80は緑、CD86は紫、CD206は黄色です。 スケールバー、100μm。 M1 サブタイプの F M-IHC 定量結果。 n=3 サンプル/グループ。 スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異の有意性を分析しました。 ***、p<0.001。 G M2 サブタイプの M-IHC 定量結果。 n=3 サンプル/グループ。 スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異の有意性を分析しました。 **、p<0.01。 H OH2 (上) および OH2 併用 CL グループ (下) における CD86 (左)、CD206 (中央)、および F4/80 (右) の代表的な IHC 染色。 元の倍率、×200。 n=5 サンプル/グループ。 (パーセンテージは、細胞の総数における M1/M2 マクロファージの割合を表しました)。 I. CL と OH2 を組み合わせた OH2 グループにおける CD86 染色の定量的結果。 J CL と OH2 を組み合わせた OH2 グループにおける CD206 染色の定量的結果。 K CL と OH2 を組み合わせた OH2 グループにおける F4/80 染色の定量的結果。 n=3 サンプル/グループ。 スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異の有意性を分析しました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001

CT26 担持マウスのマクロファージは、治療の 1 日前にクロドロネート リポソーム (CL) を使用して除去されました。 まず、クリアランス効率を検証したところ、注入後 24 時間以内にクリアランス効率が 90% 以上に達し、72 時間後には回復し、注入前のレベルよりも高くなっていることがわかりました (追加ファイル 3: 図 S7)。 これらの結果は、CL のみを使用すると、新しいマクロファージの形成に影響を与えることなく、既存のマクロファージを効果的に除去できることを示唆しています。

図 3C に示すように、OH2 療法と OH2 療法と組み合わせた CL の両方が強力な腫瘍阻害を示しました。 実際、併用療法はより早期の腫瘍抑制とより顕著な治療効果を示しました（p<0.0001）（図3C）。 しかし、2 つのグループ間に生存率の差はなく、併用グループと OH2 グループのすべての腫瘍は最終的に退縮しました (図 3D)。 再チャレンジ実験では、最終的には腫瘍が再発したものの、併用グループの腫瘍形成率はOVグループの腫瘍形成率よりも有意に低いことが示されました（p=0.029）。（追加ファイル3：図S8）。 これは、マクロファージが OH2 の治療効果に役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

マルチカラー免疫組織化学 (M-IHC) による定量分析により、CL と OH2 の併用により、腫瘍免疫微小環境における M1 マクロファージの増加 (p=0.0004) が促進され、それに伴い、M2 マクロファージの減少 (p=0.0011) が示されました。 OH2 単独 (図 3E–G、追加ファイル 3: 図 S9)。 免疫組織化学の結果は、M1 マクロファージ マーカーが腫瘍組織で高度に発現されており、併用療法群では M2 マクロファージ マーカーが低レベルでのみ発現していることを示しました（図 3H ～ K）。 これらの結果は、OH2 療法が M1 マクロファージの極性化を誘導し、生体内での抗腫瘍免疫応答に関与する可能性があることを示唆しました。

マクロファージ療法と組み合わせた OH2 の実現可能性をさらに調査するために、マクロファージの CD47-SIRPα 軸をブロックする抗 SIRPα 抗体が使用されました。 まず、細胞株における CD47 と SIRPα の発現を検出しました。 図4Aに示すように、CD47はほとんどの細胞株で広く発現していましたが、SIRPαの発現は細胞株特異的でした。 マウスの脾臓におけるマクロファージ上のSIRPαの発現レベルを追加ファイル3:図S10に示した。 これらの結果は、抗 SIRPα 抗体を使用して、マクロファージの貪食に対する CD47 の遮断効果を除去できることを示唆しました。

OH2 療法と抗 SIRPα 療法の組み合わせは、生体内での抗がん免疫応答を強化します。 A CT26、MC38、および 4T-1 細胞株における CD47 および SIRPα の発現レベルは、フローサイトメトリーによって検出されました。 B 調整された複合治療の治療プロセスと実験スケジュール。 C 初期治療時の腫瘍体積が大きい、担癌マウスの異なる治療群の腫瘍増殖曲線。 赤いボックスは拡大して、OH2 結合抗 SIRPα 抗体グループ、OH2 結合アイソタイプ、および OH2 グループを示しています。 実験データに対して二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。 n=10 マウス/グループ。 *、p=0.019。 D 初回治療時の腫瘍体積が大きい担癌マウスの異なる治療群の生存曲線。 生存曲線データには、カプランマイヤー法およびログランク検定を使用した。 *、p=0.041。 E OH2併用抗SIRPα抗体群、抗SIRPα抗体群、OH2群、コントロール群の腫瘍増殖曲線。 実験データに対して二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。 n=6 マウス/グループ。 *; **。 F OH2併用抗SIRPα抗体群、抗SIRPα抗体群、OH2群、コントロール群の生存曲線。 生存曲線データには、カプランマイヤー法およびログランク検定を使用した。 *、p=0.0183。 G 併用治療の治療プロセスと実験スケジュール。 H OH2 併用抗 SIRPα 抗体群、OH2 併用アイソタイプ、および対照群の腫瘍増殖曲線。 実験データに対して二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。 n=7 マウス/グループ。 *、p=0.029; **、P=0.0041; ***、p=0.0003。 I OH2 併用抗 SIRPα 抗体群、OH2 併用アイソタイプ、およびコントロール群の生存曲線。 生存曲線データには、カプランマイヤー法およびログランク検定を使用した。 *、p=0.03およびp=0.018; **、P=0.0014

インビボ試験を実施した。 治療開始時の CT26 腫瘍体積が小さかった場合 (45.315±4.403 mm3)、腫瘍体積と生存率は併用治療群と OH2 治療群の間で有意な差はありませんでした (p=0.4712) (追加ファイル 3: 図 1)。 S11)。 単独治療でも併用治療でも、OH2 は優れた抗腫瘍効果を発揮し、最終的には腫瘍は完全に退縮します。 次に、生体内実験を調整しました (図 4B)。 腫瘍がより大きくなった（281.596±31.469 mm3）14日目に治療を開始し、OV治療グループと併用治療グループの間で効果の差が現れ始めました（図4C）。 他のグループと比較して、併用治療グループの腫瘍はより早く退縮しました。 さらに、組み合わせグループのマウスは、OH2 および OH2+iアイソタイプグループのマウスよりも高い生存率 (P=0.041) を示しました (図 4D)。 腫瘍退縮を達成したマウスの数も最大でした。 対照群と比較して、OH2を使用した両群は腫瘍増殖を効果的に阻害し、マウスの生存を延長することができました（図4E、F）。 しかし、抗SIRPα抗体単独では、腫瘍増殖を阻害せず(P>0.05、図4E)、腫瘍担持マウスの生存期間を延長しなかった(P>0.05、図4F)。

また、4T-1 マウスモデルにおける免疫排除も検証しました (図 4G)。 図４Ｈに示すように、併用群は、ＯＨ ２ 群（ｐ＝０．００４１）および対照群（ｐ＝０．００３）とは有意に異なる強力な抗腫瘍効果を示した。 さらに、併用グループのマウスは、OH2 (p=0.03) および対照グループ (p=0.0014) のマウスよりも生存率が良好でした (図 4I)。 これらの結果は、抗SIRPα抗体がOH2療法の有効性を増強することを示した。

続いて、マウスの腫瘍組織の病理学的分析を実施しました。 病理学的結果は、治療を受けなかったマウスの腫瘍微小環境では、M2 マクロファージの割合が M1 マクロファージの割合よりもはるかに高いことを示しました (図 5A、追加ファイル 3: 図 S12)。 OH2 による治療により、腫瘍微小環境への M2 マクロファージの浸潤が減少し (p<0.001)、NK 細胞の浸潤がある程度増加しました (p<0.05) (図 5B および C)。 抗 SIRPα 抗体と OH2 を併用すると、腫瘍微小環境への CD8 T 細胞 (p<0.01) および M1 マクロファージ (p<0.001) の浸潤が増加しました (図 5D および E)。 免疫組織化学の結果は、併用治療群の免疫細胞が腫瘍の中心部分に集中していることを示した(図5F、Gおよび追加ファイル3:図S13)。 これは、これらの腫瘍阻害免疫細胞が腫瘍の中心に移動する能力が強化されたことを意味します。 これらの結果は、併用療法が単独治療よりも強力な抗腫瘍免疫反応を刺激できることを示唆しました。

抗SIRPα抗体治療モデルのM-IHCおよびIHC染色。 OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループ、OH2 併用アイソタイプ、OH2 グループ、および初期治療後の腫瘍体積が大きい対照グループの代表的な M-IHC の結果。 CD8、緑、CD16、スカイブルー、F4/80、紫、CD86、オレンジ、CD206、赤。 スケールバー、100μm。 B OH2 併用抗 SIRPα 抗体群、OH2 併用アイソタイプ、OH2 群、およびコントロール群における NK 細胞 (CD16) 染色の定量結果。 n=3 サンプル/グループ。 C OH2 併用抗 SIRPα 抗体群、OH2 併用アイソタイプ、OH2 群、およびコントロール群における M2 マクロファージ (F4/80+CD206+) 染色の定量結果。 n=3 サンプル/グループ。 D OH2 併用抗 SIRPα 抗体群、OH2 併用アイソタイプ、OH2 群、およびコントロール群における M1 マクロファージ (F4/80+CD86+) 染色の定量結果。 n=3 サンプル/グループ。 E OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループ、OH2 併用アイソタイプ、OH2 グループ、およびコントロール グループにおける CD8 T 細胞染色の定量結果。 n=3 サンプル/グループ。 F 初期治療時の腫瘍体積が大きい、OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループ、OH2 アイソタイプ併用グループ、OH2 グループ、およびコントロール グループの CD8、CD16、F4/80、CD86、および CD206 の代表的な IHC 染色。 元の倍率、×200。 n=5 サンプル/グループ。 G OH2 結合抗 SIRPα 抗体グループ、OH2 結合アイソタイプ、OH2 グループおよびコントロール グループにおける CD8、CD16、F4/80、CD86 および CD206 染色の定量結果。 n=5 サンプル/グループ。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001 (割合は細胞の総数に対する細胞の割合を表します)

RNA シーケンスと単一 RNA シーケンスを使用して、TME をより詳細に特徴付けました。 OH2 治療単独では、腫瘍免疫微小環境への適応免疫細胞 (T 細胞および Th1 細胞) および自然免疫細胞 (マクロファージおよび DC) の浸潤を促進できます (図 6A)。 併用療法グループでは、マクロファージのスコアがはるかに高かった。 有意差はありませんでしたが、DC、CD8+、および細胞毒性は、OH2 単独治療と比較して併用により改善されました (図 6B)。 抗 SIRPα と OH2 を組み合わせると、腫瘍組織、特にマクロファージ、DC、T 細胞、NK 細胞への免疫細胞の浸潤がより促進されました。 免疫細胞は全体的に活性化され、それによって抗腫瘍腫瘍微小環境が形成されました（図6C）。 免疫細胞浸潤の結果、併用治療群の腫瘍における抗原提示シグナルが増強され、免疫細胞の殺傷機能が強化された（図６Ｄ、追加ファイル３：図Ｓ１４）。 しかし、腫瘍細胞の増殖能力は低下し、アポトーシスが増加しました（図6C、追加ファイル3：図S15）。 GO 分析は、IHC の結果と一致して、白血球遊走と走化性が併用治療群で強化されたことを示しました (図 6E および F)。 腫瘍組織における免疫細胞の遊走能力の向上と機能活性化、さらには M1 関連サイトカイン、T 細胞関連サイトカイン、NK 関連サイトカインの完全な活性化により、腫瘍細胞の除去が促進されました（図 6G–I）。 ）。 これらの結果は、併用療法が TME をより深く再形成し、より強力な自然免疫応答と適応免疫応答を活性化できることを示唆しました。

さまざまな治療グループにおける腫瘍組織のRNA配列結果によって明らかになった腫瘍免疫微小環境。 A OH2併用抗SIRPα抗体群、OH2群、対照群の腫瘍組織のGSVAによる免疫細胞浸潤解析結果。 B OH2 併用抗 SIRPα 抗体群、OH2 群、およびGSVAによる対照群。 C GSVAによる、OH2結合抗SIRPα抗体群、OH2群、および対照群の腫瘍組織の免疫関連シグナル伝達経路。 D OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループの腫瘍組織の免疫関連シグナル伝達経路（インターフェロン、NK 細胞活性、細胞毒性、T 細胞プライミングと活性化、腫瘍への免疫細胞局在、サイトカイン、ケモカインシグナル伝達）のスコアリング結果、OH2 グループ、および GSVA によるコントロール グループ。 E 対照群および OH2 併用抗 SIRPα 抗体群における差次的に発現された遺伝子の GO 分析。 OH2 グループおよび OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループにおける差次的に発現された遺伝子の F GO 分析。 G OH2 グループ、抗 SIRPα 抗体グループと組み合わせた OH2 グループおよびコントロールグループにおける M1 関連サイトカインの発現レベル。 H OH2 グループ、および抗 SIRPα 抗体グループおよびコントロール グループと組み合わせた OH2 における T 細胞関連サイトカインの発現レベル。 I OH2 グループ、抗 SIRPα 抗体グループと組み合わせた OH2 グループおよびコントロールグループにおける NK 関連サイトカインの発現レベル。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異の有意性を分析しました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001。 色は、RNA シーケンスにおける遺伝子の発現レベルの値を表します。 OH2 + SIRPα は、抗 SIRPα 抗体グループと結合した OH2 を表します。

単一細胞データは、腫瘍微小環境内の免疫細胞がT細胞、B細胞、NK細胞、骨髄細胞、マスト細胞、およびDC細胞に分類できることを示しました（図7A、および追加ファイル3：図S16）。 各免疫細胞サブセットの割合を図７Ｂに示す。 対照群と比較して、OH2群およびOH2併用抗SIRPα抗体群ではT細胞、NK細胞、DC細胞が増加し、骨髄系細胞が減少した。 OH2 単独で治療したグループと比較して、併用治療グループでは NK 細胞と DC 細胞が有意に増加し、骨髄細胞が有意に減少しました (図 7B)。 異なるタイプのマクロファージの分析により、OH2 で処理した両方のグループで M1 マクロファージが増加したことが示されました (図 7C)。しかし、M1 マクロファージの増加は併用処理グループでより顕著でした (図 7D)。 OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループと他の 2 つのグループ間で差次的に発現する遺伝子が同定されました。 ウイルスの核酸断片、パッケージ化されていない無傷のキャプシドタンパク質、または細胞内容物が、PAMP/DAMP として治療に関与している可能性があります。 単一細胞配列決定データの結果は、Tlr2およびTlr13が上方制御されていることを示した(図7E)。 Tlr2およびTlr13はウイルス成分を認識し、Toll様受容体（TLR）依存性シグナル伝達経路を活性化し[22、23]、免疫細胞の機能が強力に活性化された（図7F）。

シングル RNA シークエンシングによって明らかになった腫瘍免疫微小環境により、異なる治療グループの腫瘍組織が得られます。 単一細胞データにおける免疫細胞のクラスター化。 B 単一細胞データにおける免疫細胞のさまざまなサブセットの割合。 C 単一細胞データにおけるマクロファージのクラスター化。 D 単一細胞データにおけるマクロファージのさまざまなサブセットの割合。 E OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループにおける差次的発現遺伝子のトール様受容体を示すボルケーノ プロット。 OH2 併用抗 SIRPα 抗体群における差次的発現遺伝子の F GO 解析

治療の腫瘍特異的細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 反応を検証するために、さまざまな治療グループ (コントロール、抗 SIRPα、OH2、および OH2+ 抗 SIRPα) から単離した脾臓リンパ球を、標的部位でインビトロで CT26 細胞と共培養しました。細胞/エフェクター細胞 (T:E) 比は 1:100、1:50、および 1:25。 OH2 グループと OH2+ 抗 SIRPα グループの両方のリンパ球は、CT26 細胞に対して高度に特異的な CTL 応答を示しました (p<0.001)。 抗 SIRPα 抗体と組み合わせた OH2 の CTL 応答は、OH2 単独の場合よりも強力でした (p<0.05)。 しかしながら、抗SIRPα抗体単独ではCTL応答は検出されなかった(追加ファイル3:図S17A)。 ELISA を使用して共培養細胞の上清を検出したところ、OH2 群と OH2+anti-SIRPα 群で TNF-α、Granzyme B、IFN-γ の発現が有意に誘導されることがわかりました (p<0.0001) 、追加ファイル 3: 図 S17B)。 全体として、T 細胞エフェクター サイトカインは、統計的な差はありませんでしたが、OH2 + 抗 SIRPα グループの方が OH2 グループよりもわずかに高かったです。 また、T 細胞エフェクター サイトカインは、抗 SIRPα 抗体単独では検出されませんでした。 これらの結果は、併用療法により腫瘍特異的な CTL も改善できることが示唆されました。

我々は、マウスモデルにおける腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスと抗SIRPαとの併用療法の有効性と分子的および免疫学的効果をin vitroおよびin vivoで報告する（図8）。 我々は、腫瘍細胞ライセート誘導性の OH2 が、マウス RAW264.7 マクロファージの M1 表現型への分化を効果的に活性化および誘導し、その貪食作用と腫瘍細胞に対する死滅効果を in vitro で増強できることを実証しました。 我々は、CD47-SIRPα軸をブロックするOH2と抗SIRPαの組み合わせが、マクロファージの自然免疫効果を増強することにより、治療効果を効果的に増強できることを観察した。 OH2 と抗 SIRPα の組み合わせも、腫瘍免疫微小環境のより強力な制御を示しました。

OH2 治療は、in vivo で腫瘍を殺すためにマクロファージを M1 に極性化し、OH2 治療と組み合わせた SIRPα 抗体は TME を再構築し、より包括的な抗腫瘍免疫応答を活性化します。 SIRPα抗体の導入により、TMEの細胞再構成が促進され、より早期の自然免疫応答を通じて特異的な抗腫瘍免疫応答が誘導されます。

近年、OV はがん治療の有望な新しい戦略であると考えられています。 外科療法、化学放射線療法、標的療法と比較して、OV は高い殺傷能力、正確な標的化能力、そして副作用や薬剤耐性がほとんどないことを示しています [9、24、25]。 OV は遺伝子組み換えを行うことで、腫瘍標的化能力を強化し、安全性を向上させ、抗腫瘍効果を高めることができます [26、27]。 現在、40 種類以上の OV タイプがさまざまな腫瘍の治療のための臨床試験で評価されており、そのほとんどが第 I 相試験中である [24] が、T-VEC のみが第 III 相臨床試験への参加に成功し、販売承認を取得している [28] 。

最近の研究では、現在の研究で使用された OH2 は、転移性食道がんおよび直腸がんの患者において良好な腫瘍内注射耐性と持続的な抗腫瘍活性を示しました [29]。 多数の臨床試験で OV に関する肯定的な結果が示されていますが、単剤療法剤としての有効性は限定的です [6、30、31]。 したがって、併用療法は OV の治療効果を高めるために使用される戦略の 1 つです [32、33]。

OV が腫瘍を死滅させるメカニズムには、腫瘍細胞の溶解またはアポトーシスを引き起こす腫瘍細胞での感染と複製が含まれます。さらに重要なメカニズムは、死滅した腫瘍細胞が腫瘍関連抗原を放出して、腫瘍特異的免疫応答の強化を達成することです。 [34]。 OV 療法は適応抗腫瘍免疫反応を誘導できるため、免疫チェックポイント阻害剤 (ICI) と OV の組み合わせには潜在的な臨床的価値がある可能性があります。 いくつかの研究では、前臨床研究と臨床試験の両方で、OV を CTLA-4 阻害剤または PD-1 阻害剤と組み合わせると抗腫瘍反応が改善し、患者の生存率が大幅に向上することが示されています [2、35、36、37、38]。 現在、ICI と OV の併用療法について 19 件の臨床試験が進行中であり、併用療法が OV 臨床治療選択肢のホットスポットの 1 つとなっていることが示されています [39]。

しかし、既存の併用療法は、自然免疫よりも適応免疫反応に重点を置いています。 OV が腫瘍細胞を溶解すると、多くのサイトカイン、病原体関連分子パターン (PAMP) および損傷関連分子パターン (DAMP) が放出され、自然免疫応答を活性化します。 我々のデータは、腫瘍細胞感染後のOH2溶解物がマウスマクロファージ株RAW264.7の活性化とin vitroでのM1様分極を効果的に刺激できることを示した。 RNA配列決定の結果は、RAW264.7細胞が強力な抗ウイルス免疫応答を有することを示しましたが、その後の実験では、M1様極性RAW264.7細胞も顕著な腫瘍特異的殺傷能力を示しました。 サハら。 [40]は、ICIとOVの組み合わせが、マクロファージの流入とM1様の極性化に関連するマウス神経膠腫モデルの生存をわずかに延長することを示した。 これらの結果は、マクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞と組み合わせた OV にも潜在的な応用価値があることを示唆しています。

最近の研究では、CD47-SIRPα軸がマクロファージや他の自然免疫細胞を制御する食細胞チェックポイントであることが示されており、CD47-SIRPα軸をブロックする一連の分子が腫瘍治療用に臨床開発中である[13、41]。 一部の研究グループは、全長CD47抗体を発現するoHSV1を遺伝子操作しており、転移性卵巣がんおよび神経膠芽腫のマウスモデルにおいて良好な治療効果を達成している[42、43]。 ヤオら。 [44]は、CD47陽性癌におけるSIRPα-IgG1 Fc融合遺伝子を含む新規腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果を報告した。 CD47 は通常、正常組織で高レベルで発現しているため、CD47 を介した腫瘍細胞の特異的標的化には疑問があります [45]。 SIRPαはマクロファージやDCなどの骨髄細胞で高度に発現していますが、他の免疫細胞では低レベルで発現しています。 したがって、SIRPα は CD47-SIRPα 軸にとってより理想的な標的である可能性があります [45、46]。 この研究では、腫瘍溶解性ウイルス療法が in vivo でマクロファージを効果的に動員して活性化し、M1 様分極を誘導できることを実証し、CD47-SIRPα 軸の遮断と組み合わせて OV を遮断する実現可能性を実証しました。 OH2 抗体と抗 SIRPα 抗体の組み合わせは、マウス結腸直腸癌 CT-26 モデルの治療に顕著な効果をもたらしました。 興味深いことに、初期腫瘍体積が大きいマウスでは併用療法がより効果的であることがわかりました。 これは、腫瘍サイズの増大に伴って腫瘍微小環境に浸潤した単球の数が増加したことによるものと考えられ、腫瘍溶解性ウイルス治療により腫瘍微小環境が「低温」から「高温」に切り替わり、より豊富な M1 様マクロファージの生成が誘導されたと考えられます。 これらの結果は、併用療法の異なる投与時間を最適化することで治療効果をさらに向上できることも示唆しています。

腫瘍の免疫微小環境の理解が深まるにつれ、マクロファージに基づく免疫療法が現実になりつつあります[47]。 マクロファージは、TME の多くの側面の重要な調節因子であり、直接、または T 細胞および B 細胞の機能に対する非特異的効果を通じて腫瘍特異的免疫応答を活性化できます [12、48、49]。 また、OV 療法単独または SIRPα 抗体との併用により、自然免疫応答を引き起こすために多数の NK 細胞および単球が動員されることも観察されました。これは、Ramelyte らの発見と一致しています。 [50]。 マクロファージはHSV感染の制限に重要な役割を果たしており[51、52]、単一細胞配列決定の結果は、併用療法群に関与するTLRシグナル伝達経路の活性化を示した。 我々は、併用療法は単独治療と比較して有意な抗ウイルス反応を引き起こさなかったが、マクロファージが全体的な免疫状態を活性化する可能性が高いことを観察しました。 この結果は、併用療法が腫瘍細胞のより特異的な死滅を誘導することを示唆しています。 細胞および分子レベルでの併用療法の特徴は、TME 内の免疫環境の迅速な再構築と、自然免疫および適応免疫の包括的かつ継続的な活性化に基づいています。 併用療法の有効性は、1 種類の免疫細胞だけではなく、複数の免疫相乗効果によるものです。 マクロファージは、初期の抗原提示と免疫応答の拡大に役割を果たしている可能性があります。

結論として、我々のデータは、抗SIRPα抗体と組み合わせた腫瘍溶解性ウイルス療法の実現可能性を裏付けています。 抗 SIRPα 抗体の導入により、TME の細胞再構成が促進され、より早期の自然免疫応答を通じて特異的な抗腫瘍免疫応答が誘導されます。 私たちの研究は、腫瘍溶解性ウイルス治療の新しい戦略を示唆しています。

この研究に関連するデータは、論文または補足資料に記載されています。 RNA-seq データは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手することもできます。

シグナル調節タンパク質アルファ

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス 2

腫瘍溶解性ウイルス

RNA配列決定

腫瘍微小環境環境

免疫チェックポイントの遮断

免疫原性細胞死

損傷に関連する分子パターン

病原体関連の分子パターン

無細胞上清

細胞計数キット-8

遺伝子オントロジー

京都遺伝子・ゲノム大百科

遺伝子セット濃縮分析

クロドロネートリポソーム

多色免疫組織化学的

免疫組織化学

特定の病原体を含まない

トール様受容体

細胞傷害性Tリンパ球

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この研究は、中国国家科学財団 (No. 82001758) および湖北省の主要研究開発プログラム (2020BCA062) の支援を受けました。

国家重点分子腫瘍研究所、病因・発がん部、国立がんセンター/国立がん臨床研究センター/がん病院、中国医学アカデミー、北京連合医科大学、北京、100021、中国

Defeng Kong、Zhenrong Yang、Guoliang Li、Quanyou Wu、Zhaoru Gu、Duo Wan、Qi Zhang、Xiaoli Zhang、Shujun Cheng、Kaitai Zhang

国立「111」細胞制御分子薬学センター、発酵工学重点実験室（教育省）、湖北省工業発酵イノベーションセンター、生物工学部、湖北理工大学、武漢、430068、中国

ビンレイ・リウ

国立がんセンター免疫科/国立がん臨床研究センター/中国医学アカデミーおよび北京連合医科大学がん病院、北京、100021、中国

ウェン・チャン

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WZ、KTZ、DFK が実験を設計しました。 DFKは実験を実施した。 DFK、WZ、QYW はデータ処理と統計分析を実行しました。 DFK、WZ、KTZ、および BLL が原稿を執筆、レビュー、および/または改訂しました。 ZRY、GLL、ZRG、SW、QZ、ZLZ、および SJC は、管理的、技術的、または物質的なサポート (つまり、動物実験用の手術器具の準備、データの報告または整理、データベースの構築) を提供しました。 WZ と KTZ が研究を監督しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Binlei Liu、Kaitai Zhang、または Wen Zhang との通信。

この研究は、国立がんセンター/国立がん臨床研究センター/がん病院、中国医学アカデミー、北京連合医科大学(NCC2020A308)によって完全に承認されました。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

ヒートマップ用のジーンリス。

GSVA遺伝子リスト。

細胞増殖アッセイの結果。 OH2 MOI = 1 (赤)、OH2 MOI = 0.5 (青) および未処理 (黒) グループで処理した Raw264.7 細胞株の、CCK8 アッセイによる 72 時間の細胞増殖アッセイ結果。 図S2。 OH2 ライセートは、in vitro で RAW264.7 極性化と食作用を誘導します。 A. フローサイトメトリーによる貪食の分析のデモンストレーション。 B. ライセート（赤）、CFS（青）、細胞凍結ライセート（紫）、未処理（黒）で処理したCT26、MC38、4T-1細胞株の24時間のCCK8アッセイによる細胞増殖アッセイ結果。 **、p<0.01。 図S3。 フローサイトメトリーによる処理を行わなかった RAW264.7 における M1 (F4/80+CD86+) および M2 (F4/80+CD206+) マクロファージの比率。 図S4。 ブロックされた SIRPα グループとブロックされていない SIRPα グループにおけるライセートで処理された RAW264.7 の M1 (F4/80+CD86+) および M2 (F4/80+CD206+) マクロファージの比率。 A. フローサイトメトリーによるマクロファージの分極解析のデモンストレーション。 B. さまざまな抗体のアイソタイプ制御結果の表示。 C. ブロックされた SIRPα グループとブロックされていない SIRPα グループにおける M1 (F4/80+CD86+) および M2 (F4/80+CD206+) マクロファージの比率。 D. ブロックされた SIRPα グループとブロックされていない SIRPα グループにおける M1 (F4/80+CD86+) および M2 (F4/80+CD206+) マクロファージの比率。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異の有意性を分析しました。 図S5。 細胞凍結ライセートと CFS は、in vitro で RAW264.7 極性を誘導します。 A. 各細胞株からの 1 つの代表的なサンプルのフローサイトメトリー分析の結果。 B. フローサイトメトリーによって検出された、CT26、MC38、および 4T-1 細胞の細胞凍結ライセートおよび CFS グループにおける M1 (F4/80+CD86+) サブタイプの比率。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異の有意性を分析しました。 図S6。 OH2 ライセートは、in vitro で一次マクロファージの極性化を誘導します。 A. フローサイトメトリーによるマクロファージの分極解析のデモンストレーション。 B. フローサイトメトリーによって検出された、ライセート、CFS、未処理および細胞凍結ライセートグループにおける M1 (F4/80+CD86+) サブタイプおよび M2 (F4/80+CD206+) サブタイプの割合。 データは、治療グループあたり 3 つのサンプルからの平均です。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001。 図S7。 フローサイトメトリーによって検出された CL の明らかな効率。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ***、p=0.0003; ****、p<0.0001。 図S8。 OH2 または OH2+ CL が治癒した動物の CT26 による腫瘍再攻撃。 A. CT26 細胞の腫瘍増殖曲線は、CL モデルの腫瘍が完全に退縮した後に再チャレンジされます。 B. OH2 併用対照リポソーム群および OH2 併用 CL 群における腫瘍再攻撃マウスの腫瘍形成率。 統計的差異はカイ二乗検定を使用して計算されました。 p=0.0291。 図S9。 それぞれの単一染色マーカーを含む、OH2 (左) および OH2 結合 CL グループ (右) の M-IHC 染色。 図S10。 フローサイトメトリーによって検出された、マウスの脾臓のマクロファージ上のSIRPαの発現レベル。 A. フローサイトメトリーによって検出された、マウスの脾臓のマクロファージ上のSIRPαの発現レベルの実証。 B. マウスの脾臓のマクロファージにおける SIRPα の発現レベルを示すヒストグラム (n = 3)。 図S11。 抗 SIRPα 療法と OH2 の併用は、CT26 がんモデルにおける抗がん免疫応答を強化します。 A. 併用治療の治療プロセスと実験スケジュール。 B. 初期治療時の腫瘍体積が小さい、担癌マウスの異なる治療群の腫瘍増殖曲線。 赤いボックスは拡大して、OH2 結合抗 SIRPα 抗体グループ、OH2 結合アイソタイプ、および OH2 グループを示しています。 実験データに対して二元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。 n=10 マウス/グループ。 ns、大きな違いはありません。 C. 初期治療時の腫瘍体積が小さい、担癌マウスの異なる治療群の生存曲線。 生存曲線データには、カプランマイヤー法およびログランク検定を使用した。 ns、大きな違いはありません。 図S12。 抗SIRPαモデルのM-IHC染色結果。 各単一染色マーカーを含む、コントロールグループ（左上）、OH2 グループ（右上）、OH2 結合アイソタイプグループ（左下）、および OH2 結合抗 SIRPα 抗体グループ（右下）の M-IHC スタニング。 図S13。 抗SIRPα抗体治療モデルのIHC染色と定量結果。 A. OH2併用抗SIRPα抗体群、対照群、および初回治療時の腫瘍体積が大きい抗SIRPα抗体群のCD8、F4/80、CD86およびCD206の代表的なIHC染色。 B. OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループ、コントロール グループ、および抗 SIRPα 抗体グループにおける CD8、F4/80、CD86 および CD206 染色の定量結果。 元の倍率、×200。 n=5 サンプル/グループ。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001。 図S14。 抗SIRPαモデルからの腫瘍組織のKEGG結果。 A. OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループとコントロール グループの間で差次的に発現された遺伝子の KEGG 結果。 B. OH2 結合抗 SIRPα 抗体グループと OH2 結合アイソタイプ抗体グループの間で差次的に発現された遺伝子の KEGG 結果。 図S15。 抗SIRPαモデルからの腫瘍組織のGSEA結果。 A. OH2 併用抗 SIRPα 抗体グループとコントロール グループの間で差次的に発現された遺伝子の GSEA の結果。 B. OH2 を組み合わせた抗 SIRPα 抗体グループと oHSV-2 を組み合わせたアイソタイプ抗体グループの間で差次的に発現された遺伝子の GSEA の結果。 図S16。 scRNA-seq データ解析。 A. UMAP プロットは、腫瘍細胞のクラスター (左) とグループ (右) を表します。 B. 各細胞サブクラスターのスケーリングされた平均発現を示すヒートマップ。 C. 各サブクラスターの標準マーカー遺伝子の発現値を示す UMAP プロット。 D. 各免疫細胞サブクラスターのスケーリングされた平均発現を示すヒートマップ。 C. 各免疫サブクラスターの標準マーカー遺伝子の発現値を示す UMAP プロット。 図S17。 CTLアッセイ。 A. CFSE/PI によって検出された、さまざまな癌細胞溶解物と共培養されたリンパ球の殺傷機能。 各細胞株に対して 3 つのエフェクターと標的の比率を設定しました (リンパ球:腫瘍細胞 = 25:1、50:1、および 100:1)。 データは、治療グループあたり 3 つのサンプルからの平均です。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ns、有意差なし、*、p<0.05、**、p<0.01、***、p<0.001、****、p<0.0001。 B. CTL アッセイからの上清を、ELISA によって TNF-α、グランザイム B、および IFN-γ についてテストしました。 統計分析は、多重比較を伴う ANOVA を使用して実行されました。 ns、有意差なし、****、p<0.0001。

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転載と許可

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受信日: 2022 年 3 月 9 日

受理日: 2022 年 9 月 21 日

公開日: 2022 年 10 月 31 日

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