TREM2hi 常在マクロファージは心筋細胞の恒常性を維持することで敗血症の心臓を保護します

Nature Metabolism volume 5、page 129–146 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

敗血症誘発性心筋症（SICM）は、死亡率の高い敗血症患者によく見られ、異常な免疫反応を特徴としています。 細胞の不均一性により、SICM における免疫細胞サブセットの役割を理解することは困難でした。 今回我々は、CD163+RETNLA+（Mac1）と呼ばれる心臓常在マクロファージのユニークな部分集団を同定する。このマクロファージは敗血症中に自己複製を起こし、SICMを予防する標的となり得る。 我々は、敗血症マウスモデルにおける単細胞RNA配列決定と運命マッピングを組み合わせることで、Mac1亜集団がエンドサイトーシスに富む明確なトランスクリプトームサインを有し、TREM2（TREM2hi）の高発現を示すことを実証した。 TREM2hi Mac1 細胞は、心筋細胞によって排出された機能不全のミトコンドリアを積極的に除去します。 マクロファージにおける Trem2 欠損は、Mac1 亜集団の自己複製能力を損ない、その結果、損傷したミトコンドリアの除去不全、心臓組織における過剰な炎症反応、心機能不全の悪化、生存率の低下を引き起こします。 特に、TREM2hi Mac1 細胞の心膜内投与は SICM を予防します。 我々の発見は、TREM2hi Mac1 細胞の調節が SICM の治療戦略として機能する可能性があることを示唆しています。

敗血症は世界中で約 4,900 万人が罹患しており、毎年 1,100 万人以上が死亡しています 1,2。 敗血症患者の大多数は、通常 SICM3 と呼ばれる異常な心機能を示します。 臓器機能不全の重要な要因として、SICM は駆出率 (EF) の低下を特徴とし、患者の高い死亡率と関連しています。 注目すべきことに、一過性に可逆的な心筋機能不全もSICMで観察されており、敗血症性ストレス後に心臓の恒常性が回復できることが示唆されています4,5,6。 しかし、敗血症時の心臓リハビリテーションを促進するメカニズムは完全には解明されていません。

免疫細胞は、心臓損傷後の組織恒常性の調節において重要な役割を果たします7。 心臓組織では、マクロファージが優勢な免疫細胞であり、非常に不均一で系統が多様です8、9、10。 過去 10 年間、骨髄由来マクロファージ (循環) が、心臓組織の治癒や恒常性などに関与する唯一の主要な食細胞とみなされてきました 11。 しかし、新たな証拠は、心臓常在マクロファージ（CRM）が、循環マクロファージとは独立して、壊死細胞および破片の除去、血管新生の促進、炎症の制限、および心臓損傷プロセス中の組織リモデリングにおいて基本的な役割を果たすことを示しています10,12。 13. ごく最近、ある研究で、CRM が心筋細胞によって排出された腐敗したミトコンドリアを除去して心臓の健康を維持することが示されました 14。

敗血症の心臓は、体温の上昇、低酸素症、頻脈、全身性サイトカインストームなどのストレス下で高いエネルギーを必要とします。 この病理学的変化と一致して、心臓ミトコンドリア機能不全が多くの動物研究で実証されています 15,16。 臨床的には、ミトコンドリアの機能不全は敗血症の転帰不良と直接相関しています17,18。 したがって、心臓ミトコンドリア恒常性の維持はSICMの回復に不可欠です。 しかし、免疫細胞が敗血症の心臓においてミトコンドリアの品質管理の操作者としてどのように機能するのかは、依然として完全に不明のままである。

本研究では、単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) と運命マッピング技術を組み合わせることにより、マウスの敗血症心臓における心臓免疫細胞、特に心臓マクロファージの動的変化をプロファイリングしました。 われわれは、敗血症性ストレス下で心臓機能をサポートするために重要な自己複製能力を持つCD163+RETNLA+ Mac1亜集団を同定した。 表現型と機能の詳細な分析により、Mac1 亜集団はエンドサイトーシスのトランスクリプトーム シグネチャと高い TREM2 発現によって特徴づけられることが明らかになりました。 さらに、TREM2hi マクロファージ部分集団が心筋細胞から排出されたミトコンドリアを積極的に消去し、したがって敗血症における心臓の恒常性を促進することを観察しました。 マクロファージにおける Trem2 の除去は Mac1 細胞の自己複製能力を損ない、その結果、心筋の細胞外空間に機能不全のミトコンドリアが蓄積し、敗血症後の心機能が悪化しました。 最後に、TREM2hi Mac1 細胞の心膜内投与により、心機能が改善され、SICM が予防されました。 これらの発見は、SICM の TREM2 標的免疫療法の開発の展望を提供します。

敗血症ストレス時の可逆性心筋機能不全のメカニズムを調査するために、我々は敗血症マウスモデル（盲腸結紮穿刺（CLP）モデル）を確立し、心エコー検査と心臓損傷バイオマーカーによって敗血症心臓のプロファイリングを行った。 予想通り、心機能は敗血症の進行とともに着実に悪化し、CLP の 3 日後には著しく悪化しました。 その後、心機能は徐々に回復しました（拡張データ図 1a ～ d）。 同様に、心臓損傷パラメータ（乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、トロポニンI、Anp、およびBnp）も同様の動的変化を示しました（拡張データ図1e-h）。 SICM の病理における炎症の重要な役割のため、心臓炎症マーカーが多重タンパク質アレイによって測定されました。 顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン (IL)-4、IL-1α、IL-9、インターフェロン (IFN)-γ、IL-1β、IL-21、IL-10 のレベル心臓内のβはCLPの3日後にピークに達し、その後時間の経過とともにゆっくりと減少しました（拡張データ図1i）。 これらの結果は、敗血症の進行中の心臓機能の動的変化が心臓組織の炎症環境と一致していることを示しています。

次に、scRNA-seq を使用して、SICM に関与する免疫細胞の種類と状態を特徴付けました。 代謝活性のある有核 CD45+ 細胞を、異なる時点で 14 匹のマウスから蛍光活性化細胞選別 (FACS) によって分離しました。 合計29,537個の品質管理陽性細胞がさらなる分析のために選択され、細胞あたり平均約9,362個のマッピングリードと2,718個の遺伝子が生成されました（図1aおよび拡張データ図2a）。 予想通り、不偏クラスタリング分析により、マクロファージ（Adgre1およびFcgrt）、単球（Plac8およびChil3）、好中球（S100a8/a9）、ナチュラルキラー（NK）/T細胞を含む心臓免疫細胞の複数のクラスターが明らかになりました（図1b）。 （Cd3e、Klrk1、およびIl7r）、B細胞（IgkcおよびCd79a）、および周期細胞（Mki67およびStmn1）（図1c、dおよび拡張データ図2b、c）。 それらの中で、マクロファージは、心臓内に豊富なサブクラスターのセットを備えた最も豊富な細胞でした。 各時点での免疫細胞の変化を比較することにより、マクロファージの割合がわずかに減少したが、マクロファージのサブクラスターの不均一性が CLP 後により顕著になったことを発見しました。 一方、敗血症後には、多数の好中球と単球が心筋に補充されました（図1e、f）。 scRNA-seqの結果に加えて、フローサイトメトリー分析により、敗血症進行中の心臓免疫細胞の並行変化が確認されました（拡張データ図2d、e）。

a、敗血症進行中のマウス心臓免疫細胞のscRNA-seqパイプラインを示す概略図。 SS、定常状態。 b、CLP後SS、3、7および21日における14匹のWTマウスの心臓から15のクラスターに割り当てられた29,537個の心臓免疫細胞の均一多様体近似および投影(UMAP)プロット。 3 ～ 4 匹のマウスの心臓細胞を 1 つのサンプルとして混合しました。 c、細胞タイプごとに色付けされた心臓免疫細胞のUMAPプロット。 d、選択されたクラスターマーカー遺伝子を示すヒートマップ（上、クラスターと条件によって色分けされている）と、例示的な遺伝子および細胞タイプの注釈がラベル付けされています。 e、敗血症の異なる時点におけるWTマウスからの心臓免疫細胞のUMAPプロット。cと同様に細胞型によって注釈が付けられている。 各時点は、3 匹のマウス (SS または 21 日) または 4 匹のマウス (3 または 7 日) のいずれかによって提供されます。 f、敗血症のさまざまな時点でのWTマウスからの免疫細胞タイプの分布を示す棒グラフ（拡張データ図1および2）。

ソースデータ

単球マクロファージ区画は、敗血症中の心臓免疫細胞の最大かつ最も顕著に変化した集団を表すことを考慮して、教師なしクラスター分析を実行して、心臓単球マクロファージの不均一性と役割を調査しました。 5つのマクロファージサブクラスター（Mac1〜5）、2つの単球サブクラスター（Mon1およびMon2）、および樹状細胞（DC）サブクラスターが同定されました（図2a）。 Mac1 は、心臓組織に存在するマクロファージの特徴に似た Retnla、Lyve1、Cd163、および Folr2 の発現を特徴としていました 19。 Mac2 は比較的高レベルの抗原提示遺伝子を発現し、その特徴は以前に報告された主要組織適合性複合体 (MHC)-II クラスターと一致していました 19,20。 Mac3 には、Cxcl13、Ccl8、Saa3、およびいくつかの IFN 刺激遺伝子 (Ifit3 および Irf7) が豊富でした。 このクラスターは炎症促進性であり、IFN 誘導性細胞を含んでいる可能性があります 21。 Mac4 は、Cd72 および Acp5 の発現によって同定され、これらは病理学的に炎症誘発性細胞のマーカーであることが確認されました 22。 Mac5 は CCR2+ マクロファージ 12、19、23 に対応し、これらも高レベルの抗原提示遺伝子 (H2-Aa および H2-Eb1) を発現していました。 Mon1はLy6c2の発現が高い古典的単球クラスターであったのに対し、Mon2はLy6c2の発現が低い非古典的単球クラスターであった(参考文献24、25)。 DC クラスターは、古典的な DC のマーカーとして報告されている高レベルの Xcr1、Naaa、および Irf8 によって特徴づけられました 26 (図 2b および拡張データ図 3a)。 次に、SICM の異なる段階間で 8 つのサブクラスターの相対比率の動的な違いを比較しました。 特に、Mac1 および Mac2 サブクラスターは主に定常状態の心臓に存在していましたが、Mac1 サブセットのレベルは CLP の 3 日後に劇的に減少しました。 一方、Mac3 と Mac4 のレベルは CLP の 3 日後に著しく増加しました。 ただし、CLP後7日および21日で心機能が徐々に回復するにつれて、Mac1サブクラスターが回復しました（図2c、d）。 また、フローサイトメトリーと免疫蛍光を使用して、Mac1 のマーカーとして CD163 と RETNLA を選択することで scRNA-seq の結果を確認しました。 一貫して、Mac1の相対頻度と絶対数はCLPの3日後に減少し、CLPの7日および21日後に回復しました（図2e、fおよび拡張データ図3b-d）。 その後、相関分析により、Mac1の絶対数は心臓のEFと正の相関があり、敗血症進行中の血清心筋トロポニンI（cTnI）レベルと負の相関があることがわかりました（図2g、h）。 総合すると、これらのデータは、敗血症性ストレス後の心機能不全の回復に関連する、明確な CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+Mac1 サブクラスターを明らかにします。

a、図1cの8つのクラスターに割り当てられた24,058個の単球マクロファージのUMAPプロット。 b. 上位 20 個のクラスター マーカー遺伝子 (上、クラスターと条件ごとに色分け) を示すヒート マップ。例示遺伝子とクラスターの注釈がラベル付けされています。 c、CLP後SS、3、7および21日のWTマウスからの単球-マクロファージコンパートメントのUMAPプロット。aと同様にクラスターで注釈が付けられています。 d、CLP後のWTマウスからの単球-マクロファージ区画内のクラスター分布を示す棒プロット。 e、CLP後のWTマウスからの心臓CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+マクロファージのフローサイトメトリー分析を示す代表的な等高線プロット。 f, 心臓組織 1 mg あたりの CD163+RETNLA+ マクロファージの定量。 バーは平均値±標準誤差を示します。両側 P 値は、Tukey の多重比較検定を使用した一元配置分散分析 (ANOVA) によって決定されました。 g、h、心臓CD163+RETNLA+マクロファージ数とEFおよびcTnIレベルとの相関。 データは、両側のスピアマン順位相関として表示されます。 破線は 95% 信頼区間を表します。 各記号は 1 匹の動物を表します (SS、n = 8 マウス、CLP 3 d、n = 8 マウス、CLP 7 d、n = 9 マウス、CLP 21 d、n = 10 マウス) (f、g)。 この図では、結果は 4 つの独立した実験を表しています (拡張データ図 3)。

ソースデータ

単球と Mac1 サブクラスター間の潜在的な関係を決定するために、Monocle アルゴリズム 27 によって単球 - マクロファージ コンパートメントの動的免疫状態と細胞遷移を調べました。 擬似時間解析では、単球マクロファージを 1,500 細胞にダウンサンプリングして、明確な細胞発生軌跡を提供しました。 我々は、Mac1 細胞が擬似時間軌跡の開始点に局在するのに対し、Mon1、Mon2、および DC 細胞は軌跡の終了点に存在することを観察しました。 さらに、Mac2細胞の大部分は擬似時間軌跡の終端にありましたが、Mac3細胞はMac1細胞と同様に開始分岐に局在していました（図3a、bおよび拡張データ図4a）。 単球-マクロファージ区画にわたる遺伝子発現の変化を追跡すると、マクロファージサブセットの表現型と機能を定義する発生パターンが明らかになりました。 つまり、Mac1 クラスターは、Cd163、Lyve1、Retnla、Mrc1、Gas6、および Folr2 の発現レベルが上方制御され、単球遺伝子 (Plac8 および Chil3) の発現レベルが下方制御されることによって特徴づけられました。 Mon1、Mon2、Mac5、および DC クラスターは、Ccr2、Il1b、Chil3、および Plac8 の発現が上方制御されることを特徴とし、Mac2 クラスターは、抗原提示遺伝子 (H2-Aa および H2-Ab1) の高発現が特徴でした。 これらの細胞クラスターは、Mac1 遺伝子プロファイルの発現低下を示しました (図 3c および拡張データ図 4b)。

a、単球-マクロファージの発生軌跡のMonocle予測。図2aのスーラのクラスター情報が並行してマッピングされています。 b. 各スーラベースのクラスターを個別に示した、単球-マクロファージの発生軌跡のMonocle予測。 c、擬似時間とともに上位 50 DEG のヒート マップ。 擬似時間にわたる個々のサブセットの相対位置を以下に示します。 d、ゲート付きCD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+マクロファージ、CD45+CD11b+F4/80+(非CD163+RETNLA+)マクロファージおよびCD45+CD11b+F4におけるtdTomato(CX3CR1)の発現を示す代表的な等高線プロット/80−LY6C+ 単球。 敗血症に沿った各時点で WT マウスの心臓から単離された tdTomato+ 細胞の割合を示すグラフ。 NS、重要ではありません。 e、ゲートされたCD45+CD11b+F4/80+RETNLA+マクロファージ上のtdTomato（CX3CR1）およびCD163の発現を示す代表的な等高線プロット、および心臓から単離されたCD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+tdTomato+マクロファージの絶対数を示すグラフ敗血症後の各時点での WT マウスの数。 f、CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+マクロファージにおけるKi67の発現を示す代表的なヒストグラム、およびCLP後3日目および7日目のSSにおけるKi67の平均蛍光強度(MFI)の定量化を示すグラフ。 点は個々の被験者 (d ～ f) を表します。 SS、n = 5 マウス。 CLP 3 日、n = 6 マウス。 CLP 7日、n = 7マウス。 データは平均値±標準誤差として示されています。 両側 P 値は、一元配置 ANOVA に続いて、Games-Howell の (d) または Sidak の (d – f) の多重比較検定によって決定されました。 結果は 3 つの独立した実験を表しています (拡張データ図 4)。

ソースデータ

上記の擬似時間解析結果を確認するために、我々はさらに、Rosa26-stop-tdTomatoレポーターマウスと交雑したタモキシフェン誘導性Cx3cr1CreERT2-IRES-YFPマウス系統（Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTomと呼ばれる、拡張データ図4c）を使用して、SICMでMac1細胞を追跡しました。 これらのレポーターマウスの tdTomato 蛍光シグナルは、CRM とリクルートされた単球由来マクロファージを確実に区別しました 19。 タモキシフェンの最初の投与から 1 週間後、循環単球 (CD115+CD11b+) の約 95% および心臓マクロファージ (F4/80+CD11b+) の約 89% が tdTomato+ でした。 タモキシフェンの投与から 3 週間後、循環単球は徐々に tdTomato- 単球に置き換えられましたが、心臓マクロファージへのそれらの寄与は無視できるほどでした。 5週間の時点で、心臓内のほぼ85％のマクロファージと約98％のCD163 + RETNLA + Mac1細胞がtdTomato +を保持し、その後同様のレベルで維持されました（拡張データ図4d）。 タモキシフェンの投与から 6 週間後、Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom マウスに CLP 手術を受けました。 CLPの3日後および7日後にも、CD163+RETNLA+Mac1細胞の95％以上がtdTomato+として残っていることが観察されました（図3d）。 したがって、敗血症心臓におけるtdTomato + Mac1細胞の割合と絶対数は、CLPの3日後に著しく減少し、CLPの7日後に部分的に回復しました（図3e）。 インビボでの Mac1 細胞の増殖を決定するために、Ki67 発現を評価しました。 tdTomato + Mac1細胞は、定常状態の細胞と比較して、CLPの3日後にKi67の高い発現を示し、Mac1細胞が敗血症ストレス下で活発な増殖状態を提示したことを示しました（図3fおよび拡張データ図4e）。 これらのデータは、CD163+RETNLA+Mac1 細胞が循環単球からの補充とは無関係に自己複製 CRM であり、敗血症中に急激な増殖を示すことを示唆しています。

次に、SICM の Mac1 サブセットの機能的特徴を調査しようとしました。 ジーンオントロジー（GO）濃縮分析により、Mac1で上方制御された156個の発現差のある遺伝子（DEG）が生物学的に貪食およびエンドサイトーシスに関連していることが明らかになりました（図4a）。 注目すべきことに、食作用関連遺伝子 Trem2 は他のマクロファージと比較して Mac1 細胞で上方制御されていました。 (拡張データ図 5a)。 次に、すべての細胞クラスターにおける Trem2 の発現を調べ、Trem2 が Mac1 サブセットに特に豊富に存在することを観察しました (図 4b および拡張データ図 5b)。 免疫蛍光染色により、Mac1細胞上のTREM2の発現およびCD163との共局在が示されました（図4c）。 フローサイトメトリー分析により、CD163+RETNLA+Mac1細胞は他のマクロファージと比較して高レベルのTREM2を発現することが示されました（図4dおよび拡張データ図5c）。 さらに、SICMにおけるマクロファージサブセットのリモデリングにおけるTREM2の役割を決定するために、Trem2欠損（Trem2-/-）マウスおよび野生型（WT）同腹子対照でCLPを実行し、それらの心臓の単球-マクロファージコンパートメントを分析しました。 scRNA配列による。 Trem2-/- マウスと WT マウスの単球マクロファージコンパートメントの教師なしクラスター分析では、それぞれ定常状態と CLP 3 日後のサブクラスターの同様のタイプと割合が示されました (拡張データ図 5d)。 注目すべきことに、本発明者らは、CLPの3日後にWTマウスおよびTrem2-/-マウスにおいてMac1細胞の割合が両方とも有意に減少したことを観察した(拡張データ図5e)。 CLP後7日目に、WTマウスのMac1細胞は正常な数に回復しましたが、Trem2-/-マウスのMac1細胞の割合は回復できませんでした（図4e、f）。 フローサイトメトリー分析により、WT対照と比較して、Trem2-/-マウスにおけるCD163+RETNLA+Mac1細胞のパーセンテージおよび絶対数がCLP後7日目に回復しないことが確認された（図4g）。 対照的に、他の心臓免疫細胞コンパートメントの割合は、CLP の 3 日後および 7 日後の Trem2-/- マウスにおけるマクロファージの割合の減少と、好中球の割合のわずかな増加を除いて、Trem2 欠損の影響を受けませんでした 7 d CLP 後 (拡張データ図 5f)。 さらに、CD163 + RETNLA + CRMの増殖能力が、Ki67発現によって示されるCLPの3日後にWT対照と比較してTrem2-/-マウスで有意に減少したことを明らかにした（図4h）。 これらの結果は、まとめると、TREM2 が Mac1 サブセットのマーカーであり、敗血症心臓における Mac1 細胞のリモデリングに必須であることを示唆しています。

a、GOによって分析されたMac1の上方制御されたDEGの上位20の生物学的プロセスを示すドットプロット。 赤い矢印は、エンドサイトーシス関連経路を示します。 b、単球-マクロファージ区画におけるTrem2の発現を示すUMAPプロットおよびバイオリンプロット。 c、SS（n = 5）およびCLP後7日（n = 5）のWTマウスの心臓組織におけるCD163（緑）、TREM2（赤）および核（青）の代表的な免疫蛍光画像。 点線は CD163+TREM2+ マクロファージを示します。 スケールバー、20μm。 d、SSおよび7日後のWTマウスからの心臓CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+およびCD45+CD11b+F4/80+(非CD163+RETNLA+)マクロファージにおけるTREM2発現のフローサイトメトリー分析の代表的なヒストグラムCLP。 e、CLPの7日後のWTおよびTrem2ノックアウト（KO）心臓における合計13,405個の単球マクロファージについての図2aに対応する細胞クラスタリングの結果を示すUMAPプロット。 f、CLPの7日後のWTおよびTrem2-KO心臓における単球マクロファージサブセット内のクラスター分布。 g、CLPの7日後にWT（n = 6）およびTrem2-KO（n = 6）マウスの心臓からフローサイトメトリーによって分析されたCD163 + RETNLA + マクロファージのパーセンテージおよび絶対数。 h、ゲートされたCD45 + CD11b + F4 / 80 + CD163 + RETNLA + マクロファージ上のKi67の発現を示す代表的な等高線プロット、およびWT（n = 5〜6）およびTrem2-KO（n = 6）におけるKi67発現細胞の割合を示すグラフ–7) SS および CLP 3 日後の心臓。 すべての記号はマウス (g、h) を表します。 データは平均値±標準誤差として表示されます。 両側 P 値は、対応のない t 検定 (g) および Sidak の多重比較検定を使用した一元配置分散分析 (h) によって決定されました。 結果は 3 つの独立した実験 (c、d、g、h) を表します。 拡張データの図 5 も参照してください。

ソースデータ

心筋細胞は、「エクソファー」と呼ばれる専用の小胞内の機能不全のミトコンドリアを放出しました。この小胞は、平均直径 3.5 ± 0.1 μm、平均体積 31.0 ± 2.5 μm3 であることが特徴であり 14、線虫のニューロンに記載されている構造と同様です 28。 心臓マクロファージは、これらの細胞内粒子や欠陥のあるミトコンドリアを浄化することで心臓の恒常性を維持するのに不可欠です14。 私たちのデータは、敗血症の心臓におけるマクロファージの恒常性が破壊されていることを示唆しました。 私たちは、マクロファージの恒常性の破壊により、敗血症時の心筋細胞由来の損傷したミトコンドリアの除去が損なわれる可能性があると推測しました。 まず、αMHCCreマウスとRosa26TdTomマウスを交配させたところ、生成されたマウス（CardREDマウスと呼ばれる）の心筋細胞のみが赤色蛍光を発現した。 我々は、外球として定義されるいくつかの細胞内粒子の蓄積が、敗血症CardREDマウスの心臓の細胞外空間においてミトコンドリアタンパク質Tom20と共局在することを観察した（図5a、bおよび補足ビデオ1）。 透過型電子顕微鏡（TEM）分析により、CLPの3日後に心筋細胞の周囲に遊離ミトコンドリアが顕著に蓄積していることが明らかになりました（拡張データ図6a、b）。 さらに、これらの外因性物質はフローサイトメトリーで精製されました14。 心臓外皮がミトコンドリアプローブMitoTracker GreenおよびMitoNIRに対して陽性であることを観察しました（拡張データ図6c、d）。また、膜電位の低下と過分極剤に対する応答性の喪失も示しました（拡張データ図6e）。 これらの結果は、敗血症が心臓の細胞外空間で心筋細胞によって排出された機能不全のミトコンドリアの蓄積を引き起こすことを示唆しています。

a、敗血症のCardREDマウスの心臓からの心筋細胞由来の外皮におけるTom20+物質の存在を示す免疫蛍光画像および3D再構成。 b、SSおよびCLPの3日後のCardREDマウスの心臓からの心筋細胞由来の外細胞におけるTom20+物質の存在。 視野（FOV）ごとの外光球数を示すグラフ。 グループあたり n = 6。 c、敗血症の心臓において伸長した仮足によってミトコンドリアを取り込む単核細胞のTEM画像（CLP 7 d）。 d、CardREDマウス（n = 4）の心臓からのTREM2+マクロファージ（緑）に存在するミトコンドリア（Tom20、白）を含む心筋細胞由来の外皮（赤）を示す画像。 e、MitoCard マウス (n = 4) の心臓からの TREM2+ マクロファージ (赤) に存在する心筋細胞由来のミトコンドリア (mt-Dendra2、緑)。 f、MitoCard マウス (n = 3) の心臓の TREM2+ マクロファージ (赤) のリソソーム (LAMP1、白) に局在する心筋細胞由来のミトコンドリア (mt-Dendra2、緑)。 g、TREM2+ マクロファージ (緑) は、AAV9-Tnnt2-mt-Keima 感染マウスの心臓から心筋細胞由来のミトコンドリア (mt-Keima-458、シアン) と酸性環境の一部のミトコンドリア (mt-Keima-561、赤) を取り込みました。 。 h、CD163+ マクロファージ (緑色) は、それぞれ AAV9-Tnnt2-mt-Keima に感染した WT マウスおよび Trem2-/- マウスの心臓の心筋細胞由来ミトコンドリアを飲み込みました。 CD163+ マクロファージにおける mt-Keima+ ミトコンドリアのパーセンテージを示すグラフ (グループあたり n = 5)。 各動物について、5 つの視覚化領域をランダムに選択し、5 つの Mac1 細胞を分析しました。 単一の Mac1 細胞内の mt-Keima ミトコンドリアの面積と、同じ Mac1 細胞の面積の比を計算しました。 KO グループの比率をコントロール グループの比率に正規化しました。 ｉ、ＣＬＰの７日後の、ＷＴ→ＣａｒｄＲＥＤまたはＫＯ→ＣａｒｄＲＥＤキメラからのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１６３＋ＲＥＴＮＬＡ＋マクロファージおよびＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０−ＬＹ６Ｃ＋単球における心筋細胞由来のｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の取り込み。 tdTomato の MFI の定量化を示すグラフ (グループあたり n = 6 ～ 7)。 ｊ、ＣＬＰの７日後のＷＴ→ＣａｒｄＲＥＤおよびＫＯ→ＣａｒｄＲＥＤキメラの心臓からの心筋細胞由来外細胞（赤色）におけるＴｏｍ２０＋物質（シアン）の存在。 FOV あたりの外光球数を示すグラフ (グループあたり n = 6)。 画像にはスケールバーが示されています。 バーは平均値±標準誤差 (b、h、j) および四分位範囲の中央値 (i) として表示されます。 両側 P 値は、対応のない t 検定 (b、h、j) およびマンホイットニー U 検定 (i) によって決定されました。 結果は、4 回（b）、3 回（d–f）、2 回（g–j）の独立した実験を表しています（拡張データ図 6 および 7）。

ソースデータ

遊離ミトコンドリアおよびミトコンドリア DNA (mtDNA) が心臓損傷を引き起こす可能性があることを考えると、心筋細胞由来のミトコンドリアを含む外因子の除去は、心臓の恒常性を維持し、最適な心臓機能を回復するために重要です 29,30。 次に、敗血症の心臓における機能不全のミトコンドリアの除去メカニズムを調べました。 TEM 画像は、心筋細胞に隣接するいくつかの細胞がマクロファージと同様のサイズおよび形態を示すことを示しました。 これらのマクロファージは偽足を伸ばし、敗血症心筋細胞の周囲にあるミトコンドリアを含む小胞を取り囲みました（図5cおよび拡張データ図6f）。 一貫して、共焦点および三次元（3D）画像は、TREM2 + 細胞に飲み込まれた外皮（赤）にCardREDマウスの敗血症心臓にミトコンドリアが含まれていることを示しました（図5dおよび補足ビデオ2）。

TREM2hi Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+) 細胞の貪食活性を定量化するために、CardRED マウスの心臓を用いたフローサイトメトリー分析により、Mac1 細胞では非 Mac1 細胞と比較して心筋細胞由来の tdTomato タンパク質の取り込みが高いことが明らかになりました (拡張データ図 6g)。 さらに、心筋細胞特異的ミトコンドリアレポーターマウス（MitoCard）は、mtD2Flox / FloxとαMHCCre / +マウスを交配することによって生成され、共焦点画像は心筋細胞由来のミトコンドリアがTREM2 +マクロファージに局在していることを示しました（図5eおよび補足ビデオ3）。 フローサイトメトリー分析では、TREM2hi Mac1細胞がSICM中により多くの心筋細胞由来のミトコンドリアを取り込んでいることも示されました（拡張データ図6h）。 さらに、敗血症WTマウスの心臓でTUNEL染色を行ったところ、全細胞に占めるTUNEL+cTnI+細胞の割合（TUNEL+cTnI+/4,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI））が非常に低い（約1 ％）敗血症後３日目（拡張データ図６ｉ）。 これらの結果は、TREM2hi 細胞が敗血症の心臓に由来するアポトーシス物質を取り込む可能性を排除しました。

Mac1細胞における心筋細胞由来のミトコンドリアの運命を解明するために、敗血症MitoCardマウスの心臓切片を用いてリソソームマーカーLamp1によるTREM2の免疫染色を実行し、TREM2+細胞のmt-Dendra2シグナルが部分的にLAMP1+リソソームに局在していることを観察しました（図5fおよび図5fおよび補足ビデオ 4)。 次に、アデノ随伴ウイルス血清型 9 (AAV9)-Tnnt2-mt-Keima ウイルスをパッケージ化し、AAV9 ウイルスの心筋内注射を実行して、心筋細胞のミトコンドリア (mt-Keima) における Keima タンパク質の特異的発現を確実にしました (拡張データ図) .7a)32. 免疫蛍光染色により、豊富なmt-Keima+粒子がTREM2+マクロファージに集中していることが明らかになりました（図5g）。 Keima は pH に敏感であり、励起スペクトルのピークは短波長 (中性環境では緑) から長波長 (酸性環境では赤) にシフトする可能性があります 33。 ビデオと3D画像は、TREM2 +マクロファージのmt-Keimaが、AAV9-Tnnt2-mt-Keimaウイルスを注射された敗血症WTマウスの心臓で緑色と赤色の両方の蛍光シグナルを示したことを示しました（図5gおよび補足ビデオ5）。これは、ミトコンドリアが取り込まれたことを示唆していますMac1 細胞によってアップされた細胞は、酸性のリソソーム環境に送達される可能性があります。 まとめると、これらのデータは、TREM2hi Mac1 細胞が心筋細胞由来の機能不全ミトコンドリアの除去において強力な活性を有することを示しています。

scRNA-seq データ分析により、マクロファージ集団全体における Wwp1、Ccr5、Cd36、Eps15、Cltc、Mrc1、Ccl24、Dab2、および Folr2 などのエンドサイトーシス遺伝子サインの大部分が、WT 細胞と比較して Trem2-/- マウスで減少していることが明らかになりました。拡張データ図 7b、c)。 次に、マクロファージによる心筋細胞由来のミトコンドリアの取り込みに対する TREM2 の影響を調べました。 AAV9-Tnnt2-mt-Keimaウイルスの心筋内注射を、それぞれWTおよびTrem2-/-マウスを用いて実施した。 Trem2-/-敗血症マウスは、CD163+マクロファージによる心筋細胞ミトコンドリアおよびKeimaの取り込みの減少を示しました（図5hおよび補足ビデオ5）。 次に、WTまたはTrem2-/-マウスからの骨髄細胞を放射線照射されたCardREDレシピエントマウスに移植し、8週間後にCLP手術を実施しました（拡張データ図7d）。 CLPの7日後、WT→CardRED CD163+RETNLA+ Mac1細胞は、Trem2-/-→CardRED CD163+RETNLA+ Mac1細胞よりも多くの心筋細胞由来物質を捕捉したことがわかりました（図5i）。 一貫して、免疫蛍光法は、より多くの心筋細胞由来ミトコンドリアがTrem2-/-→CardREDキメラの心臓に蓄積していることを示した(図5j)。 さらに、Trem2欠損マウスは、CLPの7日後に心筋細胞の細胞外空間に遊離ミトコンドリアの重度の蓄積を示しました（拡張データ図7e）が、これは定常状態のTrem2欠損マウスでは見つかりませんでした（拡張データ図7f） ）。 これらのデータは、TREM2 が敗血症の心臓における Mac1 細胞による損傷したミトコンドリアの除去を促進することを示唆しています。

SICMにおけるTREM2hi Mac1細胞の生理学的重要性を決定するために、CLP後のWTマウスとTrem2-/-マウスの間で生存率、心収縮機能、心損傷マーカーおよび炎症を比較した。 図6aに示すように、Trem2-/-敗血症マウスの死亡率は顕著に増加した。 さらに、心エコー検査アッセイにより、Trem2-/- マウスは、特に CLP 後 7 日および 21 日後に、WT 同腹子対照と比較して、EF、短縮率 (FS)、心拍出量 (CO) の低下によって示される心機能が悪化していることが明らかになりました (図 6b および図 6b)。拡張データ 図 8a、b)。 血清中の cTnI および LDH の濃度、ならびに心臓組織中の Anp および Bnp のメッセンジャー RNA レベルは、Trem2-/- 敗血症マウスですべて増加しました（図 6c および拡張データ図 8c-e）。 また、Trem2欠損により、CLP後の炎症誘発性メディエーターのmRNAレベルが有意に上昇しました（拡張データ図8f-i）。

a、CLP パフォーマンスを 7 日間モニタリングした後の WT (n = 18) および Trem2-/- (n = 30) マウスの生存分析。 ｂ、ｃ、ＷＴおよびＴｒｅｍ２−／−マウスをＣＬＰに供し、ＣＬＰ後ＳＳおよび３、７および２１日目に心機能を検査した。 心エコー検査によって測定されたEF%（b）（各グループn = 7〜8匹のマウス）および血清中のcTnIレベル（c）（各グループn = 5〜8匹のマウス）を示すグラフ。 d、CLPの7日後の代表的なMモード心エコー画像とWT→WTキメラ（Trem2+/+Ch）およびTrem2-/-→WTキメラ（Trem2-/-Ch）のEF％。 e、CLPの7日後の代表的な連続波ドップラー心エコー検査画像およびTrem2+/+ChおよびTrem2-/-ChキメラのE/A比。 f、心エコー検査によって測定されたCOを示すグラフ。 g、h、CLP 7 日後の Trem2+/+Ch および Trem2-/-Ch キメラの血清中の cTnI (g) および LDH (h) のレベルを示すグラフ (d – h、各グループにつき n = 11 マウス) 。 ｉ、ＣＬＰの７日後のＴｒｅｍ２＋／＋ＣｈおよびＴｒｅｍ２－／－Ｃｈキメラの血清中のＡＮＰおよびＢＮＰのタンパク質レベルを示すグラフ。 j、CLP 7 日後の Trem2+/+Ch および Trem2-/-Ch キメラの心臓組織における腫瘍壊死因子 (TNF)-α、IL-1β、IL-6、および CCL2 のタンパク質レベルを示すグラフ (i、j、各グループにつき n = 10 匹のマウス）。 k、CLPの7日後のTrem2+/+ChおよびTrem2-/-Chキメラの代表的なTEM画像（左）およびミトコンドリア損傷スコア（右）。 スケールバー、5μm。 FOVごとのミトコンドリア損傷スコアを示す棒グラフ。 各記号は TEM 画像の FOV を表します。 各グループには 4 匹のマウスがおり、各動物から 5 つの FOV がアッセイ用にランダムに選択されました。 l、m、CLPから7日後のTrem2+/+ChおよびTrem2-/-Chキメラの心臓組織溶解物中のATPレベル（l）および血清乳酸レベル（m）を示すグラフ（l、m、n = 11）各グループのマウス）。 各記号は 1 匹の動物 (b–j,l,m) を表します。 バーは平均±sem（b–f、h–l）および四分位範囲の中央値（g、m）として表示されます。 両側 P 値は、カプラン・マイヤーログランク検定 (a)、シダックの多重比較検定を使用した二元配置分散分析 (b、c)、対応のない t 検定 (d – f、h – k) およびマン –ホイットニー U 検定 (g、m)。 結果は、少なくとも 4 回（b、c）および 3 回（d-m）の独立した実験を表しています（拡張データ図 8）。

ソースデータ

骨髄由来のマクロファージは、キメラマウスの常在ミクログリアプールに寄与しています 34,35。 放射線照射を受けたレシピエント（CD45.1バックグラウンド）に、それぞれWTまたはTrem2-/-マウス（CD45.2バックグラウンド）からの骨髄細胞を移植した（拡張データ図8j）。 フローサイトメトリーアッセイは、骨髄移植（BMT）8週間後の放射線照射キメラにおけるMac1細胞再構成効率が90％を超えていることを示した（拡張データ図8k、l）。 フローサイトメトリーとリアルタイム PCR の結果、Trem2-/-→WT キメラ (Trem2-/-Ch) は、WT → WT キメラ (Trem2+/+Ch) よりも心臓マクロファージにおける TREM2 タンパク質レベルが低く、心臓組織における Trem2 mRNA レベルが低いことが明らかになりました。 )、それぞれ (拡張データ図 8m)。 BMTの8週間後、キメラマウスにCLPを施した。 マクロファージのTrem2特異的欠損が、敗血症後の心機能不全、心筋損傷、心臓炎症を悪化させることを発見しました（図6d–jおよび拡張データ図8n、o）。 さらに、Trem2-/-Chキメラは、ミトコンドリア損傷の悪化(図6k)、ATPレベルの低下(図6l)、および乳酸レベルの増加(図6m)を示した。 これらの結果は、敗血症後の心臓機能を保護するために Mac1 にとって TREM2 が不可欠であることを示唆しています。

最後に、Mac1 細胞による治療が敗血症後の心機能を保護できるかどうかを検討しました。 CD45.1 マウスの心臓から選別した TREM2hi Mac1 細胞と非 Mac1 細胞を、CLP 直後に CD45.2 マウスの心膜腔にそれぞれ移植しました。 対照動物には、同量のマトリゲル（MG）を心膜内に注射した（図7a）。 フローサイトメトリー分析により、移植されたMac1細胞および非Mac1細胞はCLP後少なくとも7日間レシピエントの心臓内で生存し、存続できることが示されました（拡張データ図9a）。 総CD45 + 細胞中のMac1細胞の割合は、MGを注射したマウスと比較して、調べた時点でMac1細胞を注射したマウスの心臓で有意に増加しました（拡張データ図9b、c）。 同様に、総CD45 + 細胞中の非Mac1細胞の割合も、MG注射マウスと比較して、調べた時点で非Mac1注射マウスの心臓で増加しました（拡張データ図9d、e）。 さらに、Mac1 細胞と非 Mac1 細胞を CellTracker Orange (CMTMR) で標識し、CLP 直後に心膜腔に移しました。 3日後、組織学的アッセイにより、移植された細胞が心筋層に広く分布していることが示された(拡張データ図9f)。 さらに、CMMTR標識Mac1細胞をMitoCardマウスに心膜内に移植しました。 3日後、共焦点画像と3D画像は、注入された細胞が心筋細胞由来のミトコンドリアを飲み込んだことを示しました（拡張データ図9gおよび補足ビデオ6）。 これらのデータは、移植された Mac1 細胞が心筋に入り、レシピエントマウスの心臓内で少なくとも 7 日間生存し、心筋細胞由来のミトコンドリアを飲み込むことができることを総合的に示しています。

a、WTマウスにおけるTREM2hi Mac1細胞移植の概略図。 WT マウスから単離した TREM2hi Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) および非 Mac1 (CD45+CD11b+ F4/80+ および非 CD163+RETNLA+) 細胞を MG と混合し、心膜腔に移植しました。 CLP直後のWTマウス（1匹あたり2×105細胞）。 対照マウスにはMGのみを注射した。 マウスを屠殺し、移植の３日後に分析した。 b〜e、代表的なMモード心エコー検査画像（b）、および心エコー検査によって測定されたEF％（c）、FS％（d）およびCO（e）を示すグラフ（b〜e、+MG、n = 5マウス; +非） -Mac1、n = 9 マウス; +Mac1、n = 10 マウス)。 f、g、血清中のcTnIおよびLDHのレベルを示すグラフ。 h、心臓組織におけるAnpおよびBnpのmRNAレベルを示すグラフ。 i、血清中のANPおよびBNPのタンパク質レベルを示すグラフ。 j、心臓組織におけるTnfα、Il1β、Ccl2およびIl6のmRNAレベルを示すグラフ。 k、心臓組織におけるTNF-α、IL-1β、IL-6およびCCL2のタンパク質レベルを示すグラフ。 l、代表的なTEM画像（左）およびミトコンドリア損傷スコア（右）。 スケールバー、5μm。 各記号は FOV を表します。 各グループには 4 匹のマウスがおり、各動物から 5 つの FOV がアッセイ用にランダムに選択されました。 m、心臓組織溶解物中のATPレベルを示すグラフ。 n、血清乳酸濃度を示すグラフ。 (f-k、m、n、+MG、n = 5 マウス、+非 Mac1、n = 9 マウス、+Mac1、n = 9 マウス)。 各記号は c ～ k、n、m の 1 匹の動物を表します。 バーは平均±標準誤差として示しています。両側 P 値は、一元配置分散分析とそれに続くゲームズハウエル (c-h,j,n,m) またはテューキー (i,k) の多重比較検定によって決定されました。 結果は 4 つの独立した実験 (b ～ n) を表しています。 拡張データ図も参照してください。 9と10。

ソースデータ

心膜内に移植された非 Mac1 細胞または MG グループと比較して、TREM2hi Mac1 細胞を移植された敗血症マウスの心臓は、心臓機能の大幅な増強を示しました（図 7b-e）。 一貫して、TREM2hi Mac1 細胞の移植により、心臓損傷（図 7f-i）、炎症（図 7j、k）、ミトコンドリア損傷（図 7l）、ATP レベルの増加（図 7m）、乳酸レベルの低下（図 7f）が改善されました。 .7n）。

次に、WT Mac1 細胞と Trem2-/- Mac1 細胞を WT または Trem2-/- マウスの心臓から単離し、CLP 直後に Trem2-/- マウスの心臓に心膜内移植 (マウスあたり 2 × 105 細胞) しました。データ図10a)。 3日後および7日後、心エコー検査により、WT Mac1細胞の移植により、Trem2-/- Mac1細胞を注射されたTrem2-/-マウスまたはMG群と比較して、敗血症マウスの心機能が有意に増強されたことが明らかになった（拡張データ図10b-d）。 一貫して、WT Mac1 細胞の移植により、心臓損傷、炎症が改善され（拡張データ図 10e-j）、ATP レベルが増加し（拡張データ図 10k）、乳酸レベルが低下しました（拡張データ図 10l）。 総合すると、これらの結果は、TREM2hi Mac1 細胞の投与が、敗血症における心機能不全の予防と救済のための潜在的な治療アプローチである可能性があることを示唆しています。

SICM 患者の死亡率は高く 4,36,37、敗血症の心臓は高エネルギー代謝と壊滅的なミトコンドリア損傷と関連しています 5,38。 マクロファージは、心臓の炎症、エフェロサイトーシス、組織のリモデリングおよびホメオスタシスに関与しています11、13、39。 しかし、敗血症の心臓における異なるマクロファージのサブセットの役割は完全には解明されていません。 本研究では、敗血症および定常状態の心臓における心臓マクロファージのサブセットを調査しました。このサブセットは、TREM2hi Mac1 細胞と定義される、TREM2 の高発現と自己複製能力を特徴としています。 TREM2 の高発現は、欠陥のあるミトコンドリアを除去し、敗血症の心臓を保護する Mac1 細胞の機能に不可欠です (拡張データ図 10m)。 さらに、CD163 + RETNLA + TREM2hi Mac1 細胞の心膜内注射は、敗血症マウスの心機能不全を予防することができました。

蓄積された研究により、定常状態および心筋梗塞などのさまざまな病理学的状況におけるマクロファージの不均一な組成および組織特異的変化が強調されています8、11、19、22。 私たちの scRNA-seq データは、マウスの定常状態の心臓に 5 つのマクロファージ集団 Mac1 ～ 5 が存在することを明らかにしました。これは以前の研究で示されていました 19。 Mac1 および Mac2 サブセットは、主要な心臓マクロファージ サブセットであり、それぞれ食作用 (Trem2) および抗原提示 (H2-Aa) 関連遺伝子の発現を特徴としていました。 Mac3～5 サブセットは、それぞれ IFN 刺激 (Irf7)、病的炎症 (CD72)、ケモカイン (Ccr2) に関連する遺伝子の割合が低く、発現量が高かった。 我々は、Mac1サブセットがCLP後3日目に減少し、7日目に回復するという動的変化を示し、これが敗血症における心機能の悪化と回復とよく相関していることを見出した。 Mac3 サブセットと Mac4 サブセットは両方とも、全身性炎症反応と骨髄動員の悪化に伴って大幅に増加しました。 最近の研究では、横行大動脈狭窄モデルにおいて、CD72 が炎症誘発性マクロファージ サブセットの重要なマーカーであることが示され、そこでは多くの遺伝子が我々の研究で同定された Mac4 と重複しており、CD72 発現 Mac4 サブセットが炎症と密接に関連していることが示唆されています。 SICM における心臓損傷。

起源に関して、心臓マクロファージは、胚由来の常在CCR2-サブセット（常在）と造血由来の動員CCR2+サブセット（循環）に細分できます11、12、13。 CCR2- サブセットは局所的な増殖を通じて補充され、代謝の安定性を媒介し、損傷後の心臓の回復を促進します 14,19。 対照的に、リクルートされた CCR2+ サブセットは炎症と酸化ストレスを増強します 40。 ディックら。 は、自己複製によって維持される TIMD4+LYVE1+MHC-IIloCCR2- 常在心臓マクロファージ サブセットが有害なリモデリングを阻害し、心筋梗塞後の心臓機能の回復を促進することを発見しました 14。 この研究に沿って、敗血症ストレスにより顕著に減少する CD163+RETNLA+ CRM (Mac1 細胞) のサブセットを同定しました。 SICM が進行すると、常在 Mac1 細胞は自己複製能力を示し、敗血症の心臓において保護的な役割を果たしました。 最近の論文では、心臓マクロファージの数が CLP 後 1 日で減少し、その後 41 日 28 日までに正常超過レベルに増加したことも示されました。 心臓マクロファージ数の回復は局所増殖が大部分を占め、末梢補充はわずか 6.2% を占めました 41。 これらの発見は、敗血症における心機能の保護における自己複製常在 Mac1 細胞の重要な役割を示唆しています。

免疫グロブリン スーパーファミリーの膜貫通受容体として、TREM2 の活性化は DAP12 リン酸化を引き起こし、その結果、細胞の増殖と生存を促進し、食作用を調節し、炎症に対抗します 42,43。 我々は、Mac1 サブセットが TREM2hi を特徴とし、その増殖が敗血症中に増強されることを観察しました。 さらに、Trem2 欠損は、健康な心臓の Mac1 細胞の数には影響を与えませんでしたが、敗血症の心臓ではこれらのマクロファージの修復を著しく阻害しました。 我々の以前の研究では、定常状態のマウスの肝臓、肺、脾臓ではTREM2がほとんど検出されないのに対し、CLP後にこれらの組織ではTREM2の発現が有意に増加し、TREM2の遮断により多微生物性敗血症が悪化したことが示され44、敗血症に対する保護効果が示唆されています。 他の臓器における TREM2+ マクロファージの特異的な機能については、さらなる研究が必要です。 以前の研究では、Trem2 欠損が病的状態におけるマクロファージの増殖の減少をもたらし 45,46、細胞周期停止を誘導することが実証されました 47。 同様に、Trem2欠損によりSICMにおけるMac1細胞の増殖が著しく減少することに気づきました。 我々の発見は、TREM2がCD163+RETNLA+Mac1部分集団の再構成を介してSICMの回復に重要な役割を果たすことを示唆しています。

細胞外ミトコンドリアと mtDNA は炎症を引き起こし、心臓損傷を引き起こす可能性があります 29,30。 最近の研究では、CRM が押し出されたミトコンドリアの残骸を除去して長寿命の心筋細胞の恒常性を維持し、保護機能を果たしていることが示されました 14。 我々の今回の発見は、機能不全のミトコンドリアが、敗血症ストレス下での心臓機能不全と並行して、心筋の細胞外空間で著しく増加していることを示した。 以前の結果 41 と一致して、敗血症は心臓細胞の生存に非常にわずかな影響を示しました。 Mac1 細胞は、SICM 内の心筋細胞由来の異常なミトコンドリアを除去する強力な能力を示しました。 さらに、Trem2 の除去は CRM のエンドサイトーシス遺伝子を下方制御し、心臓内の欠損ミトコンドリアの蓄積と心機能不全を悪化させました。 さらに、CD163+RETNLA+TREM2hi マクロファージの心膜内投与は生存して心筋細胞由来の欠損ミトコンドリアを飲み込む可能性があり、結果的に敗血症性心筋機能不全から保護します。 我々の発見は、TREM2hi Mac1 細胞が強力なエンドサイトーシス機能を持ち、敗血症中に欠陥のあるミトコンドリアを除去することによって心臓の恒常性を維持したことを示唆しています。

要約すると、我々の研究は、TREM2 の高発現を特徴とする CD163+RETNLA+ マクロファージ サブセット (Mac1) を明らかにしました。 TREM2 は、敗血症の心臓における Mac1 細胞の自己再生とリモデリングに不可欠です。 TREM2hi Mac1 細胞は欠陥のあるミトコンドリアを除去し、Mac1 細胞の移植は SICM 中の心機能の回復に貢献します。 私たちの研究は、TREM2を利用することによってこのサブセットの機能を維持することが、臨床における心疾患の潜在的な治療戦略となる可能性があることを強調しています。

C57BL/6 WT マウスは上海 SLAC 実験動物センターから入手しました。 M. Colonna のご厚意により、セントルイスのワシントン大学から Trem2-/- マウスを提供していただきました。 浙江大学の M. Shang 氏は、αMHCCre マウスを提供してくれました。 次のマウスは Jackson Laboratory から購入しました: Rosa26-stop-tdTomato、Cx3cr1CreERT2-IRES-YFP、mtD2flox/+ (B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J) および B6;CD45。 1 匹のマウス (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)。 αMHCCre マウスを Rosa26-stop-tdTomato または mtD2flox/flox と交配して、心筋細胞蛍光レポーター マウス (CardRED マウスと呼ばれます) または心筋細胞特異的ミトコンドリア蛍光レポーター マウス (MitoCard マウスと呼ばれます) を作製しました。 マウスは、特定の病原体が存在しない環境で、12 時間の明暗サイクルで飼育され、周囲温度は 22 °C に維持されました。 マウスには、照射済み飼料（SZS9126、XIETONG BIO-ENGINEERING）および滅菌水を与えた。 ケージをオートクレーブ滅菌し、週に一度交換した。 実験には雄のマウスのみを使用しました。 動物実験は浙江大学医学部の動物管理使用委員会によって承認され、施設のガイドラインに従って実施されました（参照番号2017442および2021858）。

腹部の脱毛の前に、ケタミン (50 mg kg-1) とキシラジン (5 mg kg-1) を腹腔内注射して、8 週齢の雄マウスに麻酔を投与しました。 次に、マウスの腹部の下腹部を縦方向に 1.5 cm 切開し、盲腸を摘出しました。 盲腸の遠位4分の3を4-0絹縫合糸で結紮し、結紮した盲腸に22ゲージの針で2つの穿刺を行い、亜致死性のCLP誘導性敗血症を誘発した。 次いで、糞便を押し出した後、盲腸を腹腔内に戻し、創傷を4-0絹縫合糸で縫合した。 手術後、各マウスに 1 ml の滅菌生理食塩水を与えました 48。 生存率は 2 時間ごとに 7 日間評価されました。

心臓マクロファージの運命を標識するために、Cx3cr1CreERT2-IRES-YFP マウスを Rosa26-stop-tdTomato マウスと交配させました。 6 週齢の Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom マウスに、コーン油中のタモキシフェン (Meilunbio) を 1 匹あたり 4 mg 投与し、48 時間後に再度投与しました。 5週間後、アッセイのためにマウスを屠殺しました。

骨髄細胞は、8週齢の雄のドナーマウスの大腿骨および脛骨から得られました。 まず、骨髄を予冷した PBS で洗い流しました。 赤血球溶解後、70 µm フィルターを通して単一細胞懸濁液が得られました。 合計 1 × 107 個の骨髄細胞を、致死量の放射線 (8 Gy) を照射したレシピエント雄マウスに静脈内移植しました。 キメラマウスには、飲料水を通じて抗生物質を1週間投与した。 8 週間後、モデルの構築が完了しました。

心臓特異的プロモーター cTnT を備えた mt-Keima を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス血清型 2/9 (AAV 2/9) ベクターは、前述のように設計され 14、OBiO Technology によって製造されました。 各マウスには、心臓内注射により 3 × 1011 の力価の AAV9-Tnnt2-mt-Keima ウイルスを投与しました。 6 週間後、マウスを CLP 実験に使用しました。

TRIzol (Ambion) を使用して、マウスの組織および細胞から全 RNA を取得しました。 相補的 DNA サンプルを PrimeScript RT 試薬キット (Takara) で合成し、遺伝子発現を Lightcycler 480 システム (Roche) 上の SYBR premix Ex Taq (Takara) を使用する qPCR で分析しました。 使用したプライマー配列を補足表 1 に示します。

Vevo 2100 システム (VisualSonics) を使用して、イソフルラン麻酔下のマウスに心エコー検査を実施しました。 正常な体温は加熱プラットフォームによって維持されました。 胸骨傍の標準二次元 (2D) および M モード短軸像を使用して、拡張期の左心室 (LV) 内寸 (LVIDd) および収縮期 (LVIDs)、拡張期の LV 内容積 (LVEDV) および収縮期の左心室 (LV) 内部寸法を測定しました。 (LVESV) と心拍数 (HR)。 LV EF は ((LVEDV − LVESV) / LVESV) × 100 として取得され、LV FS は ((LVIDd − LVIDs) / LVIDd) × 100 として取得され、CO は (LVEDV − LVESV) × HR として取得されました。 拡張機能障害の分析には、パルス波ドップラーによる 2D 心尖部ビューが使用されました。 拡張期初期および拡張期後期の速度ピーク波 (それぞれ E および A) が検出され、E/A 比が取得されました。 画像解析は、Vevo LAB v.3.1.0 (VisualSonics) を使用してオフラインで実行されました。

新鮮な心臓を最適な切断温度の化合物で包埋し、10 μm の切片に切断しました。 空気中で 1 時間乾燥させた後、スライドを 4% パラホルムアルデヒドで 20 分間固定し、0.1% クエン酸ナトリウム中の 0.1% Triton X-100 で 15 分間透過処理し、ブロッキング緩衝液 (3% BSA + 5% FBS + 0.1%) でブロックしました。 % Tween 20) 室温で 30 分間。 次に、組織切片を、ラット抗 CD68 (1:250 希釈; Abcam)、マウス抗 CD163 (1:100 希釈; Santa Cruz)、ラット抗 TREM2 (1:100 希釈) に対する一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 ；Ｒ＆Ｄ）、ウサギ抗Ｔｏｍ２０（１：２００希釈、アブカム）、ラット抗ＬＡＭＰ１（１：５０希釈、ＤＳＨＢ）およびｃＴｎＩ（１：２５０希釈、アブカム）。 PBSTで各5分間3回洗浄した後、スライドを結合二次抗体とともに室温で2時間インキュベートし、続いてDPBSで3回洗浄し、DAPI含有ブロッキング剤でシールした。 心筋細胞のアポトーシスを分析するために、製造元の指示に従って TUNEL キットを使用して TUNEL 染色を実行しました。 画像は、Olympus OSR 共焦点顕微鏡 (OLYMPUS IX83-FV 3000-OSR) または Zeiss LSM 880 (高速 AiryScan 搭載) で取得し、ImageJ Pro Plus v.6.0 ソフトウェア (Media Cyber​​netics) で処理しました。

ミトコンドリアを含む心筋細胞由来の小胞を分析するために、CardRED マウスのサンプルをウサギ抗 Tom20 一次抗体 (1:250 希釈、Abcam) および Alexa fluor 488 結合ロバ抗ウサギ二次抗体 (1:500 希釈、Invitrogen) で染色しました。 ）。 画像は、Zeiss LSM 880 (AiryScan 搭載) を使用して、3D 再構成のために Z ステップあたり 0.38 μm の間隔 (z = 7 ～ 8 μm) で取得されました。 上記の実験の 3D 再構成解析は、Imaris ソフトウェア v.9.7 (Bitplane) を使用して処理されました。 0.2 mm の詳細と絶対強度に基づく表面ツールを使用して心筋細胞、小胞、ミトコンドリアを再構築した後、Tom20+tdTomato+ 小胞と心筋細胞の間の距離を分析して、小胞が心筋細胞の外側にあることを示しました。 次に、サンプルごとに 5 つのランダムな FOV で Tom20+tdTomato+ 小胞を定量しました。

Mt-Keima 蛍光は、Zeiss LSM 880 (高速 AiryScan を備えた Zeiss LSM 880) を使用して、2 つの連続励起 (488 nm、緑色、561 nm、赤色) により 2 つのチャンネルでイメージングされました。 異なる実験条件下で比較するために、同一のイメージング設定を維持しました。 すべての画像を ImageJ Pro Plus v.6.0 ソフトウェア (Media Cyber​​netics) で分析し、赤色蛍光タンパク質と緑色蛍光タンパク質の面積の比を計算しました。

適用したすべての抗体を補足表 2 に示します。

収集した心臓サンプルを心室前壁から取得し、2 mm3 の立方体 (2 × 1 × 1 mm) に切断しました。 これらのサンプルを 2.5% グルタルアルデヒド (pH 7.2) 中で室温で 2 日間固定しました。 次に、標準的な方法に従って立方体をエポキシプロパン樹脂で埋め込みました。 スライスは、電荷結合素子カメラを備えた Tecnai G2 Spirit 120 kV TEM (Thermo FEI) を使用して観察およびスキャンされました。

心筋ミトコンドリアは、前述のように TEM を使用して観察され、半定量的に分析されました 49。 同じ倍率での写真撮影のために 5 つの FOV がランダムに選択され、各フィールドの約 20 個のミトコンドリアが分析のためにランダムに選択されました。 各サンプルは 100 個のミトコンドリアについて分析されました。 各ミトコンドリアは、損傷の程度に応じて 0 ～ 4 のスケールで等級付けされました (スコアが高いほど、より重篤な損傷を示します)。

メーカーの説明書に従って、血清乳酸レベルは乳酸アッセイキット (Nanjing Jiancheng) を使用して検出され、血清 LDH レベルは乳酸デヒドロゲナーゼアッセイキット (Nanjing Jiancheng) を使用してテストされ、血清 cTnI レベルはマウス cTnI ELISA キット (クラウドクローン）。 心臓内のATP含量はATPアッセイキット(Beyotime)を使用して測定し、血清ANPおよびNT-proBNPレベルはマウスELISAキット(USCN Life Science)を使用して測定した。 心臓組織溶解物中の IL-1β、IL-6、TNF-α、および CCL2 タンパク質レベルは、マウス ELISA キット (NOVUS (IL-1β および IL-6) および MULTI SCIENCES (TNF-α および CCL2)) を使用して測定しました。

イソフルラン吸入によりマウスを麻酔した。 その後、心臓を２０ｍｌの灌流緩衝液（０．８ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１×ＤＰＢＳ）で灌流して、チャンバーから末梢血を除去した。 その後、摘出した心臓の心房と弁を摘出し、心室を約 1 mm の立方体に切り刻みました。 心臓を、無血清DMEM（Gibco）中の0.25 mg ml-1のLiberase TL（Sigma-Aldrich）、20μg ml-1 DNase I（Sinopharm Chemical Reagent）および10 mM HEPES（Sigma-Aldrich）を用いて37℃で消化した。 ℃で15分間。 次に、組織懸濁液を 1,000 μl マイクロピペットを使用して粉砕しました。 得られた細胞懸濁液を７０μｍフィルターを通して得て未消化の組織塊を除去し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＨＢＳＳで希釈した。 次いで、細胞懸濁液を１５％および６０％のＰｅｒｃｏｌｌ（Ｙｅａｓｏｎ）上層に広げ、４００ｇで２０分間の密度勾配遠心分離にかけた。 液体表面間の細胞層を収集し、10mlのDPBSで洗浄して、さらなる実験のために単一細胞懸濁液を得た。

フローサイトメトリー分析では、最終容量 200 μl で単一細胞懸濁液を 4 °C で 30 分間、相対抗体で染色しました。 細胞をDPBSで洗浄し、最終容量400μlで再懸濁し、40μmフィルターで濾過した。 サンプルは、BD FACSDiva ソフトウェア v.8.0.1 によって BD Fortessa (BD Biosciences) で収集され、FlowJo v.10.6.2 ソフトウェア (TreeStar) で分析されました。 敗血症性心臓における免疫細胞および心臓マクロファージ亜集団の免疫染色およびゲーティング戦略の詳細を拡張データ図に示します。 2dと3b。

ミトコンドリア機能の測定では、L-929 線維芽細胞を対照として使用し、単離された小胞と比較して治療反応性を評価しました。 オリゴマイシン (Cell Signaling Technology、5 μM) を使用して、ミトコンドリア膜の過分極を促進しました。 カルボニルシアン化物-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (Sigma-Aldrich、2 μM) を適用して、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を脱共役させ、ミトコンドリア膜を脱分極させました。 単離された小胞と L-929 細胞の両方を 37 °C で 1.5 時間投与しました。 次に、細胞または小胞を、ミトコンドリア膜電位を測定する蛍光プローブである 1× MitoNIR (Abcam) を添加した培地中で 37 °C で 20 分間染色しました。 細胞または小胞は、BD Fortessa (BD Biosciences) によって取得されました。 MFIは、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用して分析した。

メーカーの説明書に従ってFoxp3転写因子染色バッファーセット（Thermo Fisher Scientific）で細胞を固定および透過処理し、次に上記のように抗Ki67抗体で細胞を染色することにより、Ki67発現を評価しました。

FACS ソーティングでは、単細胞懸濁液を相対抗体で 4 °C で 30 分間染色し、その後 DPBS で洗浄しました。 ペレットを200μlのDPBSで再懸濁した。 scRNA-seq 実験では、Calcein Blue AM (Thermo Fisher Scientific、4 μg ml-1) および Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher Scientific、10 μM) を 200 μl 溶液に加え、4 °C で 10 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、100μm ノズルを備えた Beckman MoFlo Astrios EQ (Beckman) で生きた有核 CD45+ 細胞を得ました。 Mac1 移植実験では、TREM2hi Mac1 (CD45+ CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) および非 Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+ および非 CD163+RETNLA+) 心臓マクロファージを、さらなる実験のために別々に選別および収集しました。

単一細胞を、5% FBS を含む RPMI 1640 に収集しました。 トリパンブルー排除により細胞の生存率が確認されました。 選別された細胞を計数し、濃度を 700 ～ 1,200 細胞 μl-1 に調整しました。 次に、単一細胞懸濁液を 10x Chromium にロードし、Chromium Single Cell 3' Reagent kits v.3 (10x Genomics) によって 10,000 個以下の単一細胞を捕捉しました。 細胞は、Chromium 装置内でゲル ビーズに分割され、そこで細胞溶解と RNA のバーコード逆転写が起こりました。 DNA増幅とライブラリー構築を行った。 ライブラリーは、LC-Bio Technology により Novaseq 6000 (Illumina) で配列決定されました。 データは、CellRanger v.4.0 (10x Genomics) を使用して GRCm38 参照ゲノムとアライメントされました。

CellRanger の出力は、教師なしクラスタリングのために Seurat (v.3.1.1) にロードされました。 1 つ未満の細胞で発現したすべての遺伝子が除去されました。 200 個未満および 6,000 個を超える遺伝子を発現し、固有の分子識別子の数が 40,000 個を超え、ミトコンドリア DNA (mtDNA) 遺伝子発現の割合が 20% を超える細胞は除外されました。 ミトコンドリア遺伝子は発現マトリックスから除外されました。

データを視覚化するために、Seurat パッケージを使用してさらに分析しました。 まず、SeuratパッケージのNormalization機能のLogNormalizeメソッドを用いて遺伝子の発現値を評価しました。 次に、FindVariableGenes 関数によって特定された非常に可変性の高い遺伝子を含む正規化された発現行列に対して主成分分析を実行しました。 上位 10 個の主成分に基づいて、加重共有最近傍グラフに基づくクラスタリング手法によって教師なしセル クラスターの結果を得ました。 クラスター特異的遺伝子を検出するために、Seurat の FindAllMarkers 関数の bimod (尤度比検定) によってマーカー遺伝子を同定しました。 他のクラスターと比較して、標的クラスター内で発現が細胞の 25% を超え、平均 log (倍数変化) >0.26 である遺伝子をマーカー遺伝子として定義しました。 細胞タイプは既知のマーカーに基づいて定義されました。 非免疫細胞マーカーを発現する細胞は除外されました。

細胞の再クラスター化、マーカー遺伝子の視覚化、DEG 分析、GO 濃縮分析、およびその他のバイオインフォマティクス分析は、OmicStudio ツール (https://www.omicstudio.cn/tool) を使用して実行されました。 DEG は、次の基準の下で、FindAllMarkers 関数を使用してデフォルト パラメーターを使用した bimod によって識別されました。(1) log (変化倍数) >0.26。 (2) P 値 <0.01; (3) min.pct > 0.1。

4つのWTサンプルからの単球とマクロファージを図2a〜dに示します。 図4e、fは、単球マクロファージコンパートメントに対するTrem2-/-の影響を比較するために、上記のように凝集および分析された、CLPの7日後のTrem2-/-サンプルおよびWT同腹子対照サンプルを示しています。

単細胞軌跡分析では、Monocle v.2.4.0 を使用して、マクロファージ/単球サブセット間の発生軌跡を調査しました 19,27。 scRNA-seq データは、Seurat ツールによってスケーリング、正規化、クラスター化され、1,500 細胞にダウンサンプリングされて Monocle オブジェクトにロードされました。 DifferentialGeneTest 関数を使用して各クラスターから DEG を推測し、最も低い q 値を持つ上位 800 個の遺伝子を使用して擬似時間解析で細胞の配列を決定しました。 発達の軌跡は、plot_cell_trajectory コマンドによってプロットされました。 軌跡の「root_state」（開始点）は、単球遺伝子の発現が低い終点として定義されました。 細胞の軌跡が構築された後、疑似時間に沿った DEG が DifferentialGeneTest 関数によって検出されました。 q 値が最も低い上位 50 個の遺伝子の擬似時間による変化は、plot_pseudotime_heatmap 関数を使用したヒート マップによって視覚化されました。 Plot_genes_in_pseudotime 関数を使用して、選択された有意な遺伝子発現レベルの動的傾向を示しました。

CardRED マウスの心臓を小片に切断し、0.25 mg ml-1 のリベラーゼ TL (Sigma-Aldrich)、20 μg ml-1 DNase I (Sinopharm Chemical Reagent) および 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich) を含む DPBS で 15 分間消化しました。 37℃で最低。 次に、穏やかにピペッティングすることによって組織懸濁液を取得した。 これらの懸濁液を 50g および 300g で連続的に遠心分離し、ペレットを廃棄しました。 次いで、上清を1,000gで遠心分離し、DPBSで洗浄した。 ペレットを200μlのDPBSで再懸濁した。 心胞を定義するために、tdTomato、CD31、および Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher Scientific、10 μM) の内因性発現を使用しました。 心小胞のゲート戦略を拡張データの図 6c に示します。 材料は、100μm ノズルを備えた Beckman MoFlo Astrios EQ (Beckman) で分別されました。

FACSで選別された細胞をDPBSで洗浄し、定量した。 心臓マクロファージ (2 × 105 細胞) を 25 μl MG (Corning) に再懸濁しました。 レシピエントマウスに麻酔をかけ、挿管した後、マウスの胸を開いて、心臓マクロファージを含むMGを30ゲージの針を使用して心膜腔に注射した。 対照動物には、25μlのMGを心膜内に注射しただけだった。

細胞生存および分布実験のために、選別された Mac1 細胞および非 Mac1 細胞を CMTMR (50 nM) で 37 °C で 20 分間染色し、その後 DPBS で洗浄しました。 標識マクロファージ (2 × 105 細胞) を 25 μl MG に再懸濁し、CLP 直後に心膜腔に移植しました。 3日後、マウスは殺されました。 心臓サンプルが収集され、凍結切片が作成されました。 標準手順に従って Zeiss LSM 880 (高速 AiryScan 搭載) を使用して画像を取得し、ImageJ Pro Plus v.6.0 ソフトウェアで分析しました。

RIPA (Applygen) を使用してマウスの心臓から総タンパク質を単離し、ガラスベースおよびサンドイッチベースの抗体マイクロアレイで上清を分析して、20 種類のサイトカインを定量的に測定しました (RayBiotech)。 各サイトカインは、アレイごとに 4 つずつ分析されました。 次に、100 μl の上清を各ウェルにロードし、4 °C で一晩インキュベートした後、十分に洗浄しました。 ビオチン標識検出抗体を 2 時間インキュベートした後、AlexaFluor 555 結合ストレプトアビジンを室温で 1 時間適用しました。 スライドは、532 nm 励起および 635 nm 発光を備えた InnoScan 300 スキャナー (Innopsys) によって分析されました。 スキャナーから生データ (画像) を取得し、Mapix v.7.3.1 ソフトウェアを使用してスポット強度 (タブ区切りの .txt ファイル) を統合しました。 データの視覚化は、Q-Analyzer ソフトウェア (RayBiotech) によって取得されました。 すべての生データは統計分析のために log2 変換されました。

すべての統計分析は、SPSS v.21.0 (IBM) または Prism v.8.0 (GraphPad Software) を使用して実行されました。 2 つのグループ間の比較では、正規分布データは対応のない両側スチューデント t 検定によって評価され、正規分布のないデータはマンホイットニー U 検定によって評価されました。 2 つ以上のグループの場合、正規分布データは一元配置分散分析または二元配置分散分析によって評価され、その後ゲームズハウエル、シダック、またはテューキーの多重比較検定が行われ、正規分布のないデータはダンの多重比較を使用したクラスカル・ウォリスによって評価されました。テスト。 相関関係はピアソンの相関係数によって分析されました。 生存率はカプランマイヤー解析とログランク検定により解析した。 データは平均値±標準誤差、または四分位範囲の中央値として表示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の scRNA-seq データは、アクセッション コード GSE190856 で Gene Expression Omnibus に寄託されています。 すべてのデータと資料は、この論文と補足情報で入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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私たちはこの論文をアンドレアス・ヘフト教授（ボン大学病院麻酔科・集中治療科）に捧げますが、残念ながらこの論文が出版される前に亡くなりました。 Hoeft 教授はこの研究において重要な役割を果たしており、その概念化に対する彼の貢献に特別に感謝します。 また、有益な議論と言語的なアドバイスをいただいた D. Neculai (浙江大学医学部細胞生物学科およびサー Run Run Shaw 病院病理学科) および M. Guan (浙江大学遺伝学研究所) に感謝します。 C. Yang (浙江大学極低温電子顕微鏡センター) に感謝します。 L. Xie と J. Li (浙江大学電子顕微鏡センター)。 S. Liu、G.Xiao、J. Xuan、X. Song、Y. Li (浙江大学医学部の中核施設) から技術支援をいただきました。 L. Wang と H. Lou (浙江大学実験動物センター) 動物研究への支援。 心エコー検査については J. Zhao と J. Lin (浙江大学医学部第二付属病院)、心筋細胞の分離と統計については X. Wang と H. Zhu (浙江大学医学部第一付属病院) が協力分析。 また、シーケンスサービスを提供してくれた LC-Bio Technology のスタッフにも感謝します。 この研究は、中国自然科学財団 (XF への 82230074、81720108025、KZ への 82072221、YJ への 81971809、XL への 92049108)、浙江省自然科学財団 (KZ への LZ22H150002)、および国家重点研究および中国の開発プログラム (2018YFC2001904 から XF および 2017YFE0196600 から XL)。

これらの著者は同様に貢献しました: Kai Zhang、Yang Wang、Shiyu Chen、Jiali Mao

故人：アンドレアス・ホーフト。

中国杭州市の浙江大学医学部第一附属病院麻酔科・集中治療部

Kai Zhang、Yang Wang、Shiyu Chen、Jiali Mao、Yue Jin、Hui Ye、Xiangming Fang

中国杭州市の浙江大学医学部附属杭州第一人民病院救命救急医学科

ヤン・ワン

中国杭州市の浙江大学医学部国立小児健康臨床研究センター小児病院

Yan Zhang、Xiwang Liu、Chenchen Gong、Xuejun Cheng、Xiaoli Huang、Qixing Chen、Xuekun Li

ドイツ、ボンのボン大学病院、麻酔科および集中治療科

アンドリュー・ホーフト

中国杭州の浙江大学医学部トランスレーショナル医学研究所

リー・シュエクン

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KZ、YW、SC、JM、XF がプロジェクトを概念化し、設計しました。 KZ と YW はフローサイトメトリー研究を実施し、scRNA-seq 分析を実施しました。 KZSC、JM、HY、CG、YZ は in vivo 研究を実施しました。 SC、JM、XL、YJ、XC、およびXHは、インビトロ実験を実施した。 YJとSCはデータの統計分析を実施しました。 AH は重要な洞察とアドバイスを提供してくれました。 XF、XL、KZ、SC、QC、YW がデータを取得し、原稿を執筆しました。 XF、XL、QC が研究を監督しました。

Qixing Chen、Xuekun Li、または Xiangming Fang に相当します。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Metabolism は、この研究の査読に貢献してくれた Andres Hidalgo 氏、José Ángel Nicolás 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Ashley Castellanos-Jankiewicz、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ad、定常状態（SS）での野生型（WT）マウスの心エコー検査によって測定された代表的な心エコー検査画像（a）およびEF％（b）、FS％（c）、およびCO（d）、1、3、7、 CLP 21 日後 (SS、n = 6 マウス、CLP 3 日、n = 6 マウス、CLP 7 日、n = 5 マウス、CLP 21 日、n = 6 マウス)。 e、f、血清中のcTnI（e）およびLDH（f）のレベルを示すグラフ。 g、h、心臓組織におけるAnp (g)、Bnp (h)のmRNAレベルを示すグラフ。 各治療につき n = 5〜6 (e、f、g、h) のマウス。 i. 22 の心臓組織溶解物サンプル (列) にわたる 14 の選択されたサイトカイン (行) のスケール発現を、異なる条件で色付けして示すヒート マップ。 bh では、各記号は 1 匹の動物を表し、データは平均値 ± SEM として表示されます。 両側 P 値は、一元配置分散分析に続いて、Games-Howell の多重比較検定 (bd、f) または Tukey の多重比較検定 (g)、Kruskal-Wallis とダンの多重比較検定 (e、h) によって決定されました。 正確な P 値が表示されます。 結果は 4 つの独立した実験 (bh) を表します。

ソースデータ

a、敗血症のさまざまな段階におけるscRNA-seqの平均固有分子識別子（UMI）（左）および遺伝子（右）数のバイオリンプロット。 各ドットはセルを表します。 b、図1cの定義された細胞型について選択されたマーカー遺伝子の発現を示すUMAPプロット。 c、図1cに対応するすべての定義された細胞タイプにおける選択されたマーカー遺伝子の発現を示すバイオリンプロット。 d、マウスの心臓におけるさまざまな種類の免疫細胞を同定するための10色フローサイトメトリーのゲーティング戦略。 e、敗血症進行中の心臓免疫細胞のパーセンテージを示すグラフ（各治療につきn = 4〜5匹のマウス）。 各記号は e 内の 1 匹の動物を表します。 データは平均値 ± SEM として表示されます。 両側 P 値は、一元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定によって決定されました (ns、有意ではありません)。 eでは実験を4回行った。

ソースデータ

a、単球マクロファージ部分集団の選択されたマーカー遺伝子の発現を示すUMAPプロット。 b、同定されたMac1細胞に対するゲーティング戦略(CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+)。 c、敗血症進行中のCD163+RETNLA+心臓マクロファージのパーセンテージを示すグラフ（SS、n = 8マウス; CLP 3日、n = 8マウス; CLP 7日、n = 9マウス; CLP 21日、n = 10マウス）。 各シンボルは 1 匹の動物を表します。 バーは平均±SEMを示します。 両側 P 値は、Games-Howell の多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。 d、敗血症の進行中の心臓組織におけるCD163（緑）、CD68（赤）、および核（青）の存在を示す代表的な免疫蛍光画像。 n = 1 グループあたり 6 匹のマウス。 スケールバー、20μm。 正確な P 値が表示されます。 結果は 4 つの独立した実験 (c、d) を表します。 SS、定常状態。

ソースデータ

a、擬似時間マッピングによる単球-マクロファージコンパートメントの発生軌跡のMonocle予測。 b、スーラのクラスターがマッピングされた、擬時間に沿ってプロットされたクラスターを定義する遺伝子発現。 c、Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTomマウスにおけるMac1細胞の系統追跡の概略図。 d、ゲート制御されたCD115+CD11b+血液単球、CD45+CD11b+F4/80+心臓マクロファージ、CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+マクロファージにおけるtdTomato（CX3CR1）の発現を示す代表的な等高線プロット、およびtdTomatoのパーセンテージを示すグラフこれらの細胞内の - 標識細胞（0週間、n = 4マウス; 1週間、n = 5マウス; 3週間、n = 5マウス; 5週間、n = 2マウス; 6週間、n = 3マウス）。 バーは平均値 ± SEM です。 e、ゲート制御されたCD45 + CD11b + F4 / 80 + CD163 + RETNLA + マクロファージ上のKi67の発現を示す代表的な等高線プロット、および定常状態（SS）でのCD45 + CD11b + F4 / 80 + CD163 + RETNLA + マクロファージで発現するKi67の割合を示すグラフ, CLPの3日後と7日後。 各シンボルは 1 匹の動物を表します。 データは平均値 ± SEM として表示されます。 両側 P 値は、Games-Howell の多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。 正確な P 値が表示されます。 結果は、5 回 (d) と 2 回 (e) の独立した実験を表します。

ソースデータ

a、定常状態の Mac1 サブセット (SS) と Mac2 サブセット (左)、Mac3 サブセットにおける遺伝子発現倍率変化 (x 軸、log2 スケール) および p 値の有意性 (y 軸、-log10 スケール) を示すボルケーノ プロットCLP 3 日後の (中央) または Mac4 サブセット (右)。 選択された重要な遺伝子が標識されました。 両側 P 値はマンホイットニー U 検定によって決定されました。 b、図1cに対応するすべての定義された免疫細胞タイプにおけるTrem2の発現を示すバイオリンプロット。 c、定常状態におけるCD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+およびCD45+CD11b+F4/80+(非CD163+RETNLA+)心臓マクロファージにおけるTREM2発現の平均蛍光強度(MFI)の定量化を示すグラフ。 CLP 後 7 日目 (各グループあたり n = 8 匹のマウス)。 各シンボルは 1 匹の動物を表します。 データは平均値 ± SEM として表示されます。 両側 P 値は、Dunn の多重比較検定を使用した Kruskal-Wallis によって決定されました。 d、定常状態およびCLP3日後のWT同腹子対照およびTrem2-KOマウスの心臓からの単球-マクロファージ区画の細胞クラスタリング結果を示すUMAPプロット。 各条件の単球マクロファージは 1000 細胞にダウンサンプリングされます。 Seuratによって得られた部分集団は、マーカー遺伝子に従って図2aで以前に特定されたものと同一でした。 e、定常状態およびCLP3日後のWT同腹子対照およびTrem2-KOマウスにおける単球マクロファージサブセットのクラスター分布を示す棒グラフ。 f、CLP後0、3および7日目のWT対照およびTrem2-KOマウスにおける心臓免疫細胞のパーセンテージを示すグラフ（各処置につきn = 4〜5マウス）。 すべての記号はマウスを表します。 データは平均値 ± SEM として表示されます。両側 P 値はマンホイットニー U 検定によって決定されました (ns、有意ではありません)。 結果は 3 つの独立した実験を表しています (c、f)。

ソースデータ

a、CLP後3日目のWTマウスの心臓の小胞を示すTEM画像。 b、定常状態（SS）またはCLP後3日目のWTマウスの心臓間質ミトコンドリア小胞（赤い矢印）を示すTEM画像。 視野 (FOV) ごとの遊離ミトコンドリア数を示す棒グラフ。 各記号は FOV を表します。 各動物から 5 つの視野がアッセイ用にランダムに選択されます (n = 3)。 c、マウスの心臓から小胞を収集するためのゲート戦略の概略図。 d、ミトコンドリア選択的プローブ MitoTracker Green および MitoNIR で染色された精製小胞のフローサイトメトリー分析 (グループあたり n = 3)。 e、基礎条件および脱分極剤（FCCP）または過分極剤（オリゴマイシン）の存在下でのMitoNIRのMFIレベルによって評価された心小胞および培養線維芽細胞におけるミトコンドリア膜電位（各グループn = 3〜4）。 f、CLP後7日目のWTマウスの心筋細胞（緑色）からミトコンドリアを含む小胞（茶色）を取り込んだ2つの単核細胞（灰色）の擬似カラーの代表的なTEM画像。 g, CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ マクロファージ、CD45+CD11b+F4/80+ (非 CD163+RETNLA+) マクロファージおよび CD45+CD11b+F4/80-LY6C+ への心筋細胞由来 tdTomato タンパク質の組み込みSS および CLP 後 7 日目の αMHCCre/+ (コントロール) および αMHCCre/+:Rosa26TdTom (CardRED) マウスからの単球 (コントロール マウス、n = 4、CardRED SS、n = 5、CardRED CLP 7 日、n = 8)。 h、CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+マクロファージ、CD45+CD11b+F4/80+(非CD163+RETNLA+)マクロファージおよびCD45+CD11b+F4/80における心筋細胞由来mt-Dendra2タンパク質の取り込み-SS および CLP 後 7 日目の αMHCCre/+ (コントロール) および αMHCCre/+:mtD2Flox/Flox (MitoCard) マウスからの LY6C+ 単球 (コントロール マウス、n = 4、MitoCard SS、n = 6、MitoCard CLP 7d、n) = 6)。 ｉ、ＳＳおよびＣＬＰ後３日目のＷＴマウスの心臓におけるＴＵＮＥＬ＋細胞およびＴＵＮＥＬ＋ｃＴｎＩ＋細胞の割合（１群あたりｎ＝６マウス）。 すべてのスケール バーは画像に示されています。 データは平均値 ± SEM (b、e、g、h、i) として表示されます。 両側 P 値は、Mann-Whitney U 検定 (b)、または Dunn の多重比較検定を使用した Kruskal-Wallis (e、g、h、i) によって決定されました。 結果は、3 回 (a、b、d、gi) と 2 回 (e、f) の独立した実験を表します。

ソースデータ

a、AAV9-Tnnt2-mt-Keimaウイルスで標識された心筋細胞ミトコンドリアの概略図。 右パネルは、それぞれウイルス感染後0、3、および6週目のWTマウスの心臓におけるmt-Keima蛍光シグナルを示す。 Keima タグ付きミトコンドリアは、中性 (Keima 458 nm、緑色) 環境と酸性 (Keima 561 nm、赤色) 環境で異なる蛍光によって示されました。 スケールバー、20μm。 b、WT同腹子対照（y軸）およびTrem2-/-マウス（x軸）からの総マクロファージ集団の平均発現レベル（log10（FPKM+1）スケール）を示す散布図。 c、WT同腹子対照およびTrem2-/-マウスからの総マクロファージにおける選択されたエンドサイトーシス遺伝子発現を示すバイオリンプロット。 d、WTまたはTrem2-/-ドナーからCardREDレシピエントマウスへの骨髄移植の研究プロトコール。 e、f、定常状態（f）およびCLP後7日（e）のWTおよびTrem2-/-マウスの心臓間質ミトコンドリア小胞を示す代表的なTEM画像、スケールバー、5μm。 視野 (FOV) あたりの遊離ミトコンドリア数の定量化を示す棒グラフ。 各記号は FOV を表します (各治療につき n = 3 匹のマウス)。 各動物からのアッセイのために 5 つの視野がランダムに選択されます。 データは平均値 ± SEM (e、f) として表示されます。 両側 P 値はマンホイットニー U 検定によって決定されました (e、f)。 結果は 2 つの独立した実験 (e、f) を表します。

ソースデータ

ai、WT、および Trem2-/- マウスを CLP に供し、定常状態 (SS) および CLP 後 3、7、および 21 日目に心機能を調べた。 FS%を示すグラフ(a); CO (b) 心エコー検査により測定。 血清中のLDHレベルを示すグラフ(c)。 心臓組織溶解物中の Anp (d)、Bnp (e)、Tnfα (f)、Il-1β (g)、Ccl2 (h)、および Il-6 (i) の mRNA レベルを示すグラフ (ab、n = 7- 8匹のマウス；c、n = 6〜8匹のマウス；d、n = 各処置につき6〜7匹のマウス）。 j、WTおよびTrem2-/-ドナー（CD45.2バックグラウンド）からWTレシピエント（CD45.1バックグラウンド）への骨髄移植（BMT）の研究プロトコール。 k、BMTの1、3、5および8週間後のレシピエントマウスにおけるゲートされたCD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+Mac1サブセットにおけるCD45.1およびCD45.2発現の代表的な等高線プロット。 l、BMT後のCD11b+F4/80+CD163+RETNLA+Mac1サブセットにおけるCD45.2+細胞のパーセンテージを示すグラフ(各グループn = 4〜7マウス)。m、ゲート制御されたCD45+CD11bにおけるTREM2発現の代表的な等高線プロットBMT 8 週間後の WT→WT キメラ (Trem2+/+Ch) および Trem2-/-→WT キメラ (Trem2-/-Ch) の両方の心臓における +F4/80+CD163+ マクロファージ。 心臓組織溶解物中の Trem2 mRNA レベルを示すグラフ (各グループにつき n = 6 匹のマウス)。 ｎ、ＣＬＰ後７日目の心臓組織溶解物中のＡｎｐおよびＢｎｐのｍＲＮＡレベルを示すグラフ（各グループにつきｎ＝１１匹のマウス）。 o、CLP後7日目の心臓組織溶解物中のTnfα、Il1β、Ccl2、およびIl6のmRNAレベルを示すグラフ(各群n=11匹のマウス)。 各シンボルは 1 匹の動物を表します。 すべてのデータは平均値 ± SEM として表示されます。 両側Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定（ａｉ、ｍｏ）またはダンの多重比較検定を用いたクラスカル・ウォリス（ｌ）によって決定した。 結果は、少なくとも４回（ａｉ、ｌ）および３回（ｍｏ）の独立した実験を表す。

ソースデータ

a、TREM2hi Mac1 細胞 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) および非 Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+ および非 CD163+RETNLA+) 細胞を CD45.1 マウスから単離しました。 Mac1 細胞または非 Mac1 細胞 (マウスあたり 2 × 105 細胞) を Matrigel (MG) と混合し、それぞれ CD45.2 マウスの心臓に移植しました。 移植の 7 日後、レシピエントの心臓からのマクロファージ (CD45.2) をフローサイトメトリー アッセイで分析しました。 b、c、細胞の1、3、および7日後のレシピエントの心臓（CD45.2）からのCD45+集団内の総Mac1（b）およびCD45.1+ Mac1（c）細胞のパーセンテージを示すグラフそれぞれ移植（各治療につき n = 6 匹のマウス）。 d、e、1、3、および7日目のレシピエントの心臓（CD45.2）からのCD45+集団内の総非Mac1（d）およびCD45.1+非Mac1（e）細胞の割合を示すグラフ。 ）それぞれ細胞移植後（各治療につきn = 5〜6匹のマウス）。 f、g、TREM2hi Mac1 細胞 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) および非 Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+ および非 CD163+RETNLA+) 細胞は、WT マウスの心臓から次のようにして取得されました。 FACSおよびCMTMRで染色。 次に、両方のタイプの細胞（マトリゲルと混合した2×105細胞/マウス）を、CLP直後にレシピエントマウスの心膜腔にそれぞれ注射しました。 f、細胞移植後3日目のレシピエントマウスの心外膜（Epi）、心筋間膜（Inter）、および心内膜（Endo）における移植細胞を示す代表的な免疫蛍光画像。 CMTMR (赤) シグナルは Mac1 細胞または非 Mac1 細胞を示します。 心外膜層（EL）。 心筋（Myo）; インナーレイヤー（IL）。 スケールバー、20μm。 g、CLP後3日目のMitoCardマウスに移植されたCMTMR標識Mac1細胞を示す代表的な免疫蛍光画像。 破線のボックス領域の 3D 再構成画像。心筋細胞由来のミトコンドリア (mtDendra2+、緑色) が移植細胞 (CMTMR+、赤色) に存在することを示しています。 核は青色 (DAPI) で表示されます。 スケールバー、10μm。 n = グループあたり 6 匹のマウス (f、g)。 バーは平均±SEMを示し、両側P値は多重比較を伴う一元配置分散分析によって決定されました(be)。 結果は、4 回 (be) と 2 回 (f,g) の独立した実験を表します。

ソースデータ

a、Trem2-/- マウスへの Mac1 細胞移植の概略図。 WT マウスおよび Trem2 -/- マウスから単離した Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) 細胞をそれぞれマトリゲル (MG) と混合し、Trem2-/- マウスの心膜腔に移植しました (2x 105 細胞/動物) CLP 直後。 対照マウスにはMGのみを注射した。 移植後 3 日または 7 日後にマウスを分析しました。 bd、心エコー検査によって測定されたEF% (b)、FS% (c)、およびCO (d)を示すグラフ。 e、f、血清中のcTnI（e）およびLDH（f）のレベルを示すグラフ。 g、h、心臓組織溶解物中のAnp（g）およびBnp（h）のmRNAレベルを示すグラフ。 i、j、CLP後3日(i)および7日(j)の心臓組織溶解物中のTnfα、Il1β、Ccl2およびIl6のmRNAレベルを示すグラフ。 k、心臓組織溶解物中のATP含量を示すグラフ。 １、血清乳酸濃度を示すグラフ。 bl、各記号は 1 匹の動物を表します (各治療につき n = 6 匹のマウス)。 すべてのデータは平均値 ± SEM として表示されます。 クラスカル・ウォリスによるダンの多重比較検定 ns による両側 P 値は有意ではありません。 m、TREM2hi Mac1が心筋細胞由来のミトコンドリアを貪食して敗血症の心臓を保護することを示す概略図。 scRNA-seq により、TREM2 と CD163 を高度に発現している心臓マクロファージのサブセットが明らかになりました。 敗血症は、大量の心筋細胞由来のミトコンドリアの放出を刺激します。 TREM2hi Mac1 細胞は欠陥のあるミトコンドリアを除去し、敗血症の心臓を保護します。 結果は 2 つの (bl) 独立した実験を表します。

ソースデータ

補足表 1 ～ 3 および補足ビデオ 1 ～ 6 の凡例。

敗血症は、心筋細胞由来の外細胞の放出を誘発します。 CardRED マウスの心臓切片の 3D 再構成では、心筋細胞由来の外皮 (赤色) にミトコンドリア (Tom20、シアン) が存在し、敗血症の心臓では Tom20 と共局在する Tomato+ 外皮の蓄積が示されています。

Mac1 細胞は、SICM 内のミトコンドリアを含む心臓外細胞を取り込みます。 CardRED マウスの心臓スライスの 3D 再構成。 Mac1 細胞 (TREM2、緑色) は心筋細胞由来の外細胞 (赤色) を貪食しました。 Mac1 細胞の Exopher にはミトコンドリアが含まれていました (Tom20、白色)。

心筋細胞由来のミトコンドリアの Mac1 細胞への移入。 MitoCard マウスの心臓スライスの 3D 再構成。 Mac1 細胞 (TREM2、赤色) は心筋細胞由来のミトコンドリア (mtDendra2、緑色) を取り込みました。

Mac1 細胞内の LAMP1+ ファゴリソソームで処理された心筋細胞由来のミトコンドリア。 MitoCard マウスの心臓スライスの 3D 再構成。 Mac1 細胞 (TREM2、赤色) によって貪食された心筋細胞由来のミトコンドリア (mtDendra2、緑色) は部分的にリソソームに局在しています (LAMP1、白色)。

Trem2 欠損は、敗血症心臓における Mac1 サブセットによる心筋細胞由来のミトコンドリアの取り込みを障害します。 パート 1: AAV9-Tnnt2-mt-Keima ウイルスで標識された心筋細胞ミトコンドリアの概略図。 Keima タグ付きミトコンドリアは、中性環境 (Keima 458nm、緑色) と酸性環境 (Keima 561nm、赤色) で異なる蛍光によって示されました。 パート 2: 3D 再構成により、AAV9-Tnnt2-mt-Keima の心臓において、TREM2+ マクロファージ (緑) が心筋細胞由来のミトコンドリア (mtKeima-458、シアン) と酸性環境の一部のミトコンドリア (mtKeima-561、赤) を取り込むことが示されました。 -感染したマウス。 パート 3: CD163+ マクロファージ (緑色) は、AAV9-Tnnt2-mt-Keima に感染した WT および Trem2-/- マウスの心臓内の心筋細胞由来ミトコンドリア (mtKeima-458、シアン、mtKeima-561、赤色) を取り込みました。

移植された Mac1 細胞は、SICM 内の心筋細胞由来のミトコンドリアを飲み込みます。 MitoCard マウスの心臓スライスの 3D 再構成。 注入された Mac1 細胞 (CMTMR、赤色) は、心筋細胞由来のミトコンドリア (mtDendra2、緑色) を貪食しました。

単一細胞 RNA 配列データと統計ソース データ。

単一細胞 RNA 配列データと統計ソース データ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

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統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

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単一細胞 RNA 配列データと統計ソース データ。

統計ソースデータ。

単一細胞 RNA 配列データと統計ソース データ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Zhang, K.、Wang, Y.、Chen, S. 他 TREM2hi 常在マクロファージは、心筋細胞の恒常性を維持することで敗血症の心臓を保護します。 Nat Metab 5、129–146 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42255-022-00715-5

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受信日: 2022 年 2 月 4 日

受理日: 2022 年 11 月 22 日

公開日: 2023 年 1 月 12 日

発行日：2023年1月

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00715-5

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